本文摘要：摘要：目的建立適合膽炎康膠囊微生物限度檢查的方法。方法按照2015版中國藥典要求，依照樣品成分，取稀釋倍數(shù)為1:80的供試液，采用直徑150mm平皿進(jìn)行計數(shù)方法的回收試驗，采用常規(guī)法(培養(yǎng)基分別為100mL，100mL，10mL)進(jìn)行大腸埃希菌、沙門菌、耐膽鹽革蘭陰性
摘要：目的建立適合膽炎康膠囊微生物限度檢查的方法。方法按照2015版中國藥典要求，依照樣品成分，取稀釋倍數(shù)為1:80的供試液，采用直徑150mm平皿進(jìn)行計數(shù)方法的回收試驗，采用常規(guī)法(培養(yǎng)基分別為100mL，100mL，10mL)進(jìn)行大腸埃希菌、沙門菌、耐膽鹽革蘭陰性菌的檢查。
結(jié)果需氧菌、霉菌和酵母總數(shù)計數(shù)方法回收比值均大于0.7，高于藥典最低值0.5規(guī)定;控制菌檢查陽性對照組均能檢出相應(yīng)陽性菌。結(jié)論該方法適用性試驗所建立方法重現(xiàn)性好，可用于膽炎康膠囊的微生物限度檢查。
關(guān)鍵詞：膽炎康膠囊,微生物限度,方法適用性試驗
膽炎康膠囊由土大黃、黃岑、連錢草、虎耳草、小花清風(fēng)藤等八味中藥組成[1]，該品種屬于具有獨家批準(zhǔn)文號的苗藥品種，其功能為清熱利濕，排石止痛[2]。藥品微生物控制是藥品安全性保障的重要措施[3]，對于非無菌藥品來說微生物限度檢查是保證微生物控制的有效手段。而建立符合中國藥典規(guī)定的微生物限度檢查方法，是實現(xiàn)藥品微生物控制的重要前提。本研究通過藥品方法適用性試驗，制定了符合本品實際情況的微生物檢查方法。
1材料與儀器
1.1試劑與藥品
菌種：金黃色葡萄球菌，CMCC(B)26003;銅綠假單胞菌，CMCC(B)10104;枯草芽孢桿菌，CMCC(B)63501;乙型副傷寒沙門菌，CMCC(B)50094;大腸埃希菌，CMCC(B)44102;黑曲霉，CMCC(F)98003;白色念珠菌，CMCC(F)98001;均購自中國食品藥品檢定研究院。
培養(yǎng)基：沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基SDA、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基SDB、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、腸道增菌培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸瓊脂，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSB、麥康凱液體培養(yǎng)基均購自北京三藥科技開發(fā)公司;RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。藥品：膽炎康膠囊(批號：20170706、20170903、20171204，貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司)。
1.2主要儀器
生物安全柜(BSC-00ⅡB2，蘇凈安泰)、水浴鍋(DK-98-ⅡA，天津泰斯特)、低溫培養(yǎng)箱(KB240，BINDER)、恒溫培養(yǎng)箱(BF240，BINDER)。
2方法與結(jié)果
2.1菌液制備
參照2015版中國藥典四部通則1105、1106[4]“菌液制備”項進(jìn)行。
2.2供試液制備稱取樣品5份，每份10g，分別加TSB制成稀釋倍數(shù)為1:10、1:20、1:50、1:80、1:100的供試液。
2.3計數(shù)方法適用性試驗[4]
2.3.1預(yù)試驗試驗組(a)需氧菌計數(shù)：分別取1:20、1:50、1:100供試液，各稀釋倍數(shù)分別加入“2.1”項下制備好的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液，混勻，使每mL的供試液中含菌量不大于100cfu。
分別取2mL上述混合液，注于兩個平皿(d=90mm)中(每皿1mL)，倒入15mLTSA，34℃培養(yǎng)3d計數(shù)。霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)：分別取1:10、1:50、1:80供試液，各稀釋倍數(shù)分別加入“2.1”項下制備好的白色念珠菌、黑曲霉，混勻，使每mL的供試液中含菌量不大于100cfu。
分別取2mL上述混合液，注于兩個平皿(d=90mm)中(每皿1mL)，倒入15mLSDA，23℃培養(yǎng)5d計數(shù)。試驗組(b)需氧菌計數(shù)：分別取1:20、1:50、1:80供試液，注于直徑為150mm的平皿中，倒入約70mLTSA，其它操作同“試驗組(a)”。霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)：分別取1:10、1:50、1:80供試液，注于直徑為150mm的平皿中，倒入約70mLTSA，其它操作同“試驗組(a)”。
供試液對照組：以TSB代替菌液，其它操作同“試驗組(a)”與“試驗組(b)”。菌液對照組：以TSB代替供試液，其它操作同“試驗組(a)”與“試驗組(b)”。
2.3.2預(yù)試驗結(jié)果
采用直徑為90mm平皿，按試驗組(a)方法，選取批號為20170706的樣品進(jìn)行預(yù)試驗，該品種樣品對金黃色葡萄球菌與白色念珠菌的生長均有抑制作用。
在需氧菌計數(shù)部分，當(dāng)供試液稀釋倍數(shù)為1:50時金黃色葡萄球菌的回收比值升至0.69，說明抑菌作用得到一定消除;當(dāng)稀釋倍數(shù)到1:100時，白色念珠菌回收比值為0.51，稍大于2015版中國藥典規(guī)定的下限0.5。在霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)預(yù)試驗中，白色念珠菌的生長受到強(qiáng)烈抑制，當(dāng)供試液稀釋倍數(shù)為1:80回收比值為0.45，不能達(dá)到藥典規(guī)定要求;由于限度規(guī)定要求，無法再擴(kuò)大霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)的供試液稀釋倍數(shù)。故考慮采用更大直徑平皿來進(jìn)行回收比值試驗。
采用直徑為150mm的平皿，按試驗組(b)方法，當(dāng)稀釋倍數(shù)為1:80時，其在TSA、SDA上的回收比值分別為0.87、0.77，藥品的抑菌作用得到較好消除。故采用直徑為150mm的平皿，選取供試液稀釋倍數(shù)1:80，進(jìn)行正式試驗。
2.3.3正式試驗結(jié)果
可知采用直徑150mm平皿，當(dāng)供試液稀釋倍數(shù)為1:80時，各株菌回收比值均在0.5~2.0范圍內(nèi)，說明樣品對計數(shù)方法試驗菌的影響得到了有效消除。
2.4控制菌檢查法適用性試驗[4]
2.4.1大腸埃希菌檢查
各取1:10供試液10mL，分別加入100mLTSB中，加入不大于100cfu大腸埃希菌，34℃培養(yǎng)18h。取1mL培養(yǎng)物至100mL麥康凱液體，43℃培養(yǎng)24h后，劃線于麥康凱瓊脂上，34℃培養(yǎng)18h后，觀察并鑒定菌落。
2.4.2耐膽鹽革蘭陰性菌檢查
取3個批號1:10供試液2mL，分別加至10mL腸道菌增菌液(每管1mL)，每批號樣品混合物中分別加入小于100cfu大腸埃希菌與銅綠假單胞菌，34℃培養(yǎng)24h后，劃線于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂上，34℃培養(yǎng)18h，觀察并鑒定菌落。
2.4.3沙門氏菌檢查
取10g供試品加100mL，34℃培養(yǎng)18h后，取0.1mL接種至10mLRV沙門菌增菌液體中，34℃培養(yǎng)18h，劃線于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂上，34℃培養(yǎng)18h，觀察并鑒定菌落。
2.4.4結(jié)果
當(dāng)TSB為100mL時，大腸埃希菌和沙門菌均能檢出;當(dāng)腸道菌增菌液為10mL時，耐膽鹽革蘭陰性菌檢查對應(yīng)陽性菌可檢出。
3討論
本研究樣品組分中的土大黃[5-6]、黃芩[7-8]、穿心蓮[9]對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌有較強(qiáng)的抑制作用。本研究嘗試通過擴(kuò)大供試液稀釋倍數(shù)來提升回收比值，但當(dāng)采用一般常用的直徑90mm平皿、稀釋倍數(shù)為1:80時，霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)回收比值仍達(dá)不到0.5，若再增大供試液稀釋倍數(shù)則不利于結(jié)果的判定(藥典規(guī)定限值為102cfu·mL-1);另外該品種藥品含有較多藥渣，不宜采用薄膜過濾法。故考慮采用直徑150mm平皿，通過擴(kuò)大TSA、SDA培養(yǎng)基的體積消除進(jìn)一步抑菌作用以建立適宜檢查方法。
關(guān)于采用大于常規(guī)直徑平皿進(jìn)行檢查方法建立，在《中國藥典分析檢測技術(shù)指南》[10]中，有“可使用大平皿增加取樣量以減少取樣誤差”的描述。在已發(fā)表文獻(xiàn)中，李輝等[11]通過大平皿來解決低限值外用藥的取樣問題。但目前未查閱到采用大平皿來進(jìn)一步消除樣品抑菌性的報道。
本研究結(jié)果表明，對同樣稀釋倍數(shù)供試液，采用大平皿計數(shù)的白色念珠菌回收比值高于常規(guī)平皿法的;就其在TSA上生長而言，采用大平皿稀釋倍數(shù)為1:80時回收比值甚至高于采用常規(guī)平皿稀釋倍數(shù)為1:100的結(jié)果。說明結(jié)合擴(kuò)大供試液稀釋倍數(shù)、采用直徑較大平皿進(jìn)行試驗，是消除不利于薄膜過濾樣品抑菌作用的適宜方法。
參考文獻(xiàn)
[1]國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)頒布件-膽炎康膠囊：WS-10805(ZD-0805)-2002-2012Z[S](2002年11月16日)[2018年12月11日].
[2]成培光，李曉云，劉青梅.高效液相色譜法測定膽炎康膠囊中黃芩苷的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2010,26(5):442-443.
[3]胡昌勤.藥品微生物控制現(xiàn)狀與展望[J].中國藥學(xué)雜志，2015,50(20)：1747-1751.
[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2015年版)[S].4部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015:140-150.
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