本文摘要：摘要目的:建立地龍蚓激酶生物效價測定方法，通過測定地龍的蚓激酶生物活性，比較不同基原、不同炮制方法地龍的差異性，進而對地龍產(chǎn)地加工與應(yīng)用提出一定的理論依據(jù)和建議。方法:用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算蚓激酶生物效價，從方法耐用性、專屬性、線性范圍、精密度、
摘要目的:建立地龍蚓激酶生物效價測定方法，通過測定地龍的蚓激酶生物活性，比較不同基原、不同炮制方法地龍的差異性，進而對地龍產(chǎn)地加工與應(yīng)用提出一定的理論依據(jù)和建議。方法:用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算蚓激酶生物效價，從方法耐用性、專屬性、線性范圍、精密度、回收率等方面對的地龍中蚓激酶生物效價測定的瓊脂糖纖維蛋白平板法進行了方法學(xué)考察.并分別測定不同來源不同炮制方法的地龍的蚓激酶生物活性。
結(jié)果:不同瓊脂糖、不同纖維蛋白原對本法測定影響較小，陰性對照無干擾;本法線性范圍為12.5～400U，回收率為86.16%，精密度試驗RSD為0.98%;地龍藥材的蚓激酶生物活性在低于60度時基本穩(wěn)定�？疾觳煌瑏碓�、不同炮制方法地龍22批，表明地龍蚓激酶生物效價差異很大。結(jié)論:瓊脂糖纖維蛋白平板法可以快速、簡便、準(zhǔn)確地測定蚓激酶的生物活性，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以控制測定的誤差，本法可評價不同來源和不同炮制方法地龍的蚓激酶生物活性，指導(dǎo)和規(guī)范研發(fā)、產(chǎn)地加工、生產(chǎn)和臨床單位對地龍正確合理的使用。
關(guān)鍵詞:地龍,纖維蛋白原,蚓激酶,生物效價,基原
地龍為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)、通俗環(huán)毛蚓PheretimavulgarisChen、威廉環(huán)毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)或櫛盲環(huán)毛蚓PheretimapectiniferaMichaelsen的干燥體，前一種習(xí)稱“廣地龍”，后三種習(xí)稱“滬地龍”[1]。用于治療血栓[2]，頑固性發(fā)熱，驚厥，哮喘等。主要有效成分有纖溶酶，蚓激酶，膠原酶，次黃嘌呤[3]，琥珀酸，花生四烯酸，γ-氨基丁酸等。地龍在使用過程中具有偽品較多，基源混亂[4]的問題，《中華人民共和國藥典》(以下簡稱版《中國藥典》)2015年版項目包括性狀鑒別，顯微鑒別，兩個薄層鑒別，雜質(zhì)，水分，總灰分，酸不溶性灰分，重金屬，黃曲霉，浸出物。
該版《中國藥典》收載的鑒別項目為檢測氨基酸和對照藥材，其方法的專屬性不強;此外，對地龍的生物活性成分沒有質(zhì)控項，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能直接反應(yīng)臨床療效，不能有效地控制地龍的質(zhì)量。已有報道地龍生物活性測定方法非常少，本實驗室曾報道溶栓膠囊中蚓激酶效價測定方法[5]，采用纖維蛋白平板法，統(tǒng)計方法為量反應(yīng)平行線法。本文旨在研究一種與地龍臨床活血化淤功效相關(guān)的生物活性檢測方法，以建立成熟可行的生物活性測定質(zhì)量控制方法，并用此方法評價不同來源和不同炮制方法對其地龍質(zhì)量的影響，同時指導(dǎo)和規(guī)范研發(fā)、生產(chǎn)、臨床單位對地龍正確合理的使用。
1試驗材料
1.1儀器
萬能高速粉碎機(浙江紅景天工貿(mào)有限公司);LC-365A超聲波中藥處理機(濟寧市中區(qū)魯超儀器廠);電熱鼓風(fēng)干燥箱(MemmertUF110);游標(biāo)卡尺(哈爾濱量具刀具廠)。直徑10cm的培養(yǎng)皿若干。
1.2標(biāo)準(zhǔn)品及試劑
蚓激酶對照品(批號140650-201703、140650-201804)、纖維蛋白原(牛血)(批號140607-201740、140607-201137、140607-200736)、牛凝血酶(批號140605-201526、140605-200424、140605-201124)均為中國食品藥品檢定研究院提供。纖維蛋白原(批號411H021)及瓊脂糖購自Solarbio。
1.3樣品
地龍藥材20110901，20110902，20111001均由山西省食品藥品檢驗所提供，用DNA測序鑒定法鑒定。
2方法與結(jié)果
2.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品，用0.9%氯化鈉溶液制成5.0、10.0、20.0U·μL-1的溶液。
2.2供試品溶液的制備
取地龍藥材粉碎至無塊狀，精密稱定5g，至100mL量瓶中，加0.9%氯化鈉溶液約30mL，超聲30min，定容。搖勻，取適量4000r·min離心3min后，過濾，即得。每批樣品制備2個平行樣。
2.3瓊脂糖-纖維蛋白平板制備
取瓊脂糖1.5g，加工作溶液[pH7.8磷酸鹽緩沖液與0.9%氯化鈉溶液(1∶17)混合]100mL加熱溶解。取1.5mg·mL-1纖維蛋白原溶液20mL，置燒杯中，邊攪拌邊加入55℃瓊脂糖溶液20mL、15BP·mL-1凝血酶溶液0.6mL，立即混勻，快速倒入2個直徑10cm平皿中，室溫水平放置30分鐘，鋪板厚度約為3.5mm，每個平皿上等距離均勻的打四個直徑為2mm的點樣孔，備用。
2.4培養(yǎng)測定
精密量取不同濃度的蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液各10μL，分別點在同一平皿中，加蓋，每份樣品做兩個平皿，置37℃恒溫箱中反應(yīng)18h。取出后用卡尺測量溶圈垂直兩直徑，計算溶圈面積(垂直兩半徑的乘積乘以3.14)。
2.5數(shù)據(jù)處理
標(biāo)準(zhǔn)曲線法是以標(biāo)準(zhǔn)品點樣單位量(U)為橫坐標(biāo)，溶圈面積為縱坐標(biāo)求回歸方程，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算供試品的效價。
3方法學(xué)考察
3.1專屬性試驗
按供試品溶液制備方法制備不加樣品的陰性對照溶液，即空白溶液，采用上述方法測定效價。陰性對照樣品未出現(xiàn)溶液溶圈。證明在本法條件下，陰性對照無干擾。
3.2耐用性試驗
3.2.1不同凝血酶不同凝血酶對實驗結(jié)果的影響
分別用兩個批號凝血酶(牛血)鋪板，按照效價方法測定2批地龍的效價。不同凝血酶對實驗結(jié)果的影響，說明不同批號的凝血酶對本法測定無明顯影響。
3.2.2不同纖維蛋白原對實驗結(jié)果的影響
分別用兩個批號纖維蛋白原鋪板，按照效價方法測定2批地龍的效價。說明不同批號的纖維蛋白原對本法測定無明顯影響。
3.3線性范圍
取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品加0.9%氯化鈉注射液制成每1μL含蚓激酶為10、2.5、0.625U的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取上述10U·μL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液40、20、10μL和上述2.5U·μL-1、0.625U·μL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL、20μL點樣，測定溶圈面積。以點樣量(U)為橫坐標(biāo)，溶圈面積為縱坐標(biāo)求得回歸方程:Y=0.9824X+97.651R2=0.9531點樣量在12.5～400U范圍內(nèi)。
3.4準(zhǔn)確度試驗
采用加樣回收法測定。取已知含量樣品(批號20111001，效價898U·mg-1)，稱取6份，(每份約0.5g)，分別精密稱定，再精密量取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品200502，效價100U·μL-1)800μL分別加入樣品中，按供試品溶液制備方法制備，并按本文中效價測定方法檢測，回收率計算方法為(測量效價-樣品效價)/標(biāo)準(zhǔn)品加入量×100%。本法回收率為86.16%，RSD為9.65%。
3.5精密度試驗
取供試品溶液(批號為20111001)，連續(xù)點樣5板，測定效價。測定精密度試驗RSD為0.98%。
3.6熱穩(wěn)定性考察
取4批地龍樣品，提取液采用不同溫度30、40、50、60、70、80、90℃溫度水浴20min后，按溶栓圈直徑乘積進行纖溶圈大小比較。提取溫度為30～60℃，效價基本穩(wěn)定，70℃時效價降低，80℃以上則樣品基本喪失活性。說明溫度對樣品效價有明顯影響，所以在生產(chǎn)，儲存，提取時采用不加熱超聲，并且提取過程應(yīng)避免溫度過高。
4對不同來源不同炮制的地龍生物效價的考察
取收集的不同來源的地龍樣品，按制定的蚓激酶生物效價測定法進行效價測定�？梢姴煌瑏碓�、不同炮制方法、儲存時間對中藥地龍的蚓激酶生物效價差異很大。
5討論
5.1纖溶生物活性測定法
地龍含有酶類、蛋白質(zhì)、多脂類、氨基酸、微量元素和其他成分等，具有通絡(luò)，活血化瘀功效，用于關(guān)節(jié)痹痛、肢體麻木、半身不遂等�，F(xiàn)代研究表明:地龍體內(nèi)溶栓成分主要有多種溶纖酶和十幾種激酶。研究證明蚓激酶在體外具有很強的纖溶活性，故本品采用體外纖維蛋白平板法測定其纖溶生物活性。
5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定效價
現(xiàn)報道地龍纖溶生物活性測定法多采用蚓激酶效價測定法，有量反應(yīng)平行法，還有采用單點法測量溶圈直徑或面積來計算。前者一般原則為標(biāo)準(zhǔn)品和樣品為同質(zhì)，考慮地龍可能除了含有蚓激酶具有溶纖的成分外，還含有多種溶纖酶和激酶、蛋白質(zhì)等其他成分，故沒有采用量反應(yīng)平行法。后者單點法測定其效價，結(jié)果受試劑如纖維蛋白和凝血酶、點樣誤差、平板制備等多種因素影響，重現(xiàn)性較差。故本實驗采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定其纖溶生物效價，可以有效地控制實驗誤差。
5.3對炮制工藝考察
炮制工藝采用冷凍干燥、40度干燥、室溫陰干等三種方法進行考察、結(jié)果冷凍干燥工藝地龍體外纖溶生物效價最高，其次低溫干燥(40℃)、室溫陰干，其余曬干的樣品效價均遠(yuǎn)低于前者，因此如果地龍用于活血通絡(luò)時，炮制方式首選凍干處理，其次為室溫陰干和低溫干燥，如果需低溫干燥時，生產(chǎn)關(guān)鍵參數(shù)溫度需控制在40℃以下為宜。
5.4熱穩(wěn)定性考察
隨著溫度的升高，地龍纖溶生物活性呈下降趨勢，但在60℃以下較穩(wěn)定，提示在炮制、中藥提取和儲運過程中應(yīng)嚴(yán)格控制注意溫度。
6小結(jié)
本實驗建立的地龍蚓激酶生物效價檢測方法操作簡單，專屬性強，耐用性良好，能有效評價不同產(chǎn)地，不同炮制方法地龍的纖溶生物活性。樣品檢測結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地，不同炮制方法的地龍纖溶生物效價差異很大，雖有些產(chǎn)地來源的地龍無法獲取具體的炮制工藝參數(shù)，但從生產(chǎn)批號可以推測隨著儲存時間的延長，生物活性呈下降趨勢，2016年生產(chǎn)的地龍生物效價低于檢出限。本品為動物源藥材，主要含有多種酶、蛋白和氨基酸等成分，應(yīng)對中藥材前處理、提取、貯運過程中的溫度進行控制。
本實驗采用體外纖溶生物活性評價不同來源不同炮制的地龍質(zhì)量，前期本實驗室對其體內(nèi)體外藥效相關(guān)性進行了研究，結(jié)果顯示具有良好的相關(guān)性，因此體外纖溶生物活性測定法是用于評價地龍?zhí)崛±w溶成分工藝穩(wěn)定性和可行性的一種有效的手段。但此方法僅限于對于地龍臨床用于通絡(luò)活血類的病癥的評價。鑒于地龍除了具有通絡(luò)活血化瘀的作用外，還具有清熱定驚，平喘，利尿等功效。目前階段對于此方面功效成分和生物活性相關(guān)性有待于進一步研究。
參考文獻
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[2]程牛亮，牛勃，張祖殉，等.地龍?zhí)崛∥飳嶒炐匝ǖ娜芙庾饔眉坝行С煞值难芯縖J].山西醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1989，20(4):203
中藥方向論文投稿刊物：《中藥材》(月刊)創(chuàng)刊于1978年，由國家藥品監(jiān)督管理局主管，國家藥品監(jiān)督管理局中藥材信息中心站主辦。主要報道中藥材的種(養(yǎng))技術(shù)(GAP)，資源開發(fā)和利用，藥材的加工炮制與養(yǎng)護，鑒別，成分，藥理，臨床，制劑，用藥等方面的研究論文。
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