本文摘要：摘要目的:建立地龍蚓激酶生物效價(jià)測定方法，通過測定地龍的蚓激酶生物活性，比較不同基原、不同炮制方法地龍的差異性，進(jìn)而對(duì)地龍產(chǎn)地加工與應(yīng)用提出一定的理論依據(jù)和建議。方法:用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算蚓激酶生物效價(jià)，從方法耐用性、專屬性、線性范圍、精密度、
摘要目的:建立地龍蚓激酶生物效價(jià)測定方法，通過測定地龍的蚓激酶生物活性，比較不同基原、不同炮制方法地龍的差異性，進(jìn)而對(duì)地龍產(chǎn)地加工與應(yīng)用提出一定的理論依據(jù)和建議。方法:用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算蚓激酶生物效價(jià)，從方法耐用性、專屬性、線性范圍、精密度、回收率等方面對(duì)的地龍中蚓激酶生物效價(jià)測定的瓊脂糖纖維蛋白平板法進(jìn)行了方法學(xué)考察.并分別測定不同來源不同炮制方法的地龍的蚓激酶生物活性。
結(jié)果:不同瓊脂糖、不同纖維蛋白原對(duì)本法測定影響較小，陰性對(duì)照無干擾;本法線性范圍為12.5～400U，回收率為86.16%，精密度試驗(yàn)RSD為0.98%;地龍藥材的蚓激酶生物活性在低于60度時(shí)基本穩(wěn)定。考察不同來源、不同炮制方法地龍22批，表明地龍蚓激酶生物效價(jià)差異很大。結(jié)論:瓊脂糖纖維蛋白平板法可以快速、簡便、準(zhǔn)確地測定蚓激酶的生物活性，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以控制測定的誤差，本法可評(píng)價(jià)不同來源和不同炮制方法地龍的蚓激酶生物活性，指導(dǎo)和規(guī)范研發(fā)、產(chǎn)地加工、生產(chǎn)和臨床單位對(duì)地龍正確合理的使用。
關(guān)鍵詞:地龍,纖維蛋白原,蚓激酶,生物效價(jià),基原
地龍為鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)、通俗環(huán)毛蚓PheretimavulgarisChen、威廉環(huán)毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)或櫛盲環(huán)毛蚓PheretimapectiniferaMichaelsen的干燥體，前一種習(xí)稱“廣地龍”，后三種習(xí)稱“滬地龍”[1]。用于治療血栓[2]，頑固性發(fā)熱，驚厥，哮喘等。主要有效成分有纖溶酶，蚓激酶，膠原酶，次黃嘌呤[3]，琥珀酸，花生四烯酸，γ-氨基丁酸等。地龍?jiān)谑褂眠^程中具有偽品較多，基源混亂[4]的問題，《中華人民共和國藥典》(以下簡稱版《中國藥典》)2015年版項(xiàng)目包括性狀鑒別，顯微鑒別，兩個(gè)薄層鑒別，雜質(zhì)，水分，總灰分，酸不溶性灰分，重金屬，黃曲霉，浸出物。
該版《中國藥典》收載的鑒別項(xiàng)目為檢測氨基酸和對(duì)照藥材，其方法的專屬性不強(qiáng);此外，對(duì)地龍的生物活性成分沒有質(zhì)控項(xiàng)，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能直接反應(yīng)臨床療效，不能有效地控制地龍的質(zhì)量。已有報(bào)道地龍生物活性測定方法非常少，本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道溶栓膠囊中蚓激酶效價(jià)測定方法[5]，采用纖維蛋白平板法，統(tǒng)計(jì)方法為量反應(yīng)平行線法。本文旨在研究一種與地龍臨床活血化淤功效相關(guān)的生物活性檢測方法，以建立成熟可行的生物活性測定質(zhì)量控制方法，并用此方法評(píng)價(jià)不同來源和不同炮制方法對(duì)其地龍質(zhì)量的影響，同時(shí)指導(dǎo)和規(guī)范研發(fā)、生產(chǎn)、臨床單位對(duì)地龍正確合理的使用。
1試驗(yàn)材料
1.1儀器
萬能高速粉碎機(jī)(浙江紅景天工貿(mào)有限公司);LC-365A超聲波中藥處理機(jī)(濟(jì)寧市中區(qū)魯超儀器廠);電熱鼓風(fēng)干燥箱(MemmertUF110);游標(biāo)卡尺(哈爾濱量具刀具廠)。直徑10cm的培養(yǎng)皿若干。
1.2標(biāo)準(zhǔn)品及試劑
蚓激酶對(duì)照品(批號(hào)140650-201703、140650-201804)、纖維蛋白原(牛血)(批號(hào)140607-201740、140607-201137、140607-200736)、牛凝血酶(批號(hào)140605-201526、140605-200424、140605-201124)均為中國食品藥品檢定研究院提供。纖維蛋白原(批號(hào)411H021)及瓊脂糖購自Solarbio。
1.3樣品
地龍藥材20110901，20110902，20111001均由山西省食品藥品檢驗(yàn)所提供，用DNA測序鑒定法鑒定。
2方法與結(jié)果
2.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品，用0.9%氯化鈉溶液制成5.0、10.0、20.0U·μL-1的溶液。
2.2供試品溶液的制備
取地龍藥材粉碎至無塊狀，精密稱定5g，至100mL量瓶中，加0.9%氯化鈉溶液約30mL，超聲30min，定容。搖勻，取適量4000r·min離心3min后，過濾，即得。每批樣品制備2個(gè)平行樣。
2.3瓊脂糖-纖維蛋白平板制備
取瓊脂糖1.5g，加工作溶液[pH7.8磷酸鹽緩沖液與0.9%氯化鈉溶液(1∶17)混合]100mL加熱溶解。取1.5mg·mL-1纖維蛋白原溶液20mL，置燒杯中，邊攪拌邊加入55℃瓊脂糖溶液20mL、15BP·mL-1凝血酶溶液0.6mL，立即混勻，快速倒入2個(gè)直徑10cm平皿中，室溫水平放置30分鐘，鋪板厚度約為3.5mm，每個(gè)平皿上等距離均勻的打四個(gè)直徑為2mm的點(diǎn)樣孔，備用。
2.4培養(yǎng)測定
精密量取不同濃度的蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液各10μL，分別點(diǎn)在同一平皿中，加蓋，每份樣品做兩個(gè)平皿，置37℃恒溫箱中反應(yīng)18h。取出后用卡尺測量溶圈垂直兩直徑，計(jì)算溶圈面積(垂直兩半徑的乘積乘以3.14)。
2.5數(shù)據(jù)處理
標(biāo)準(zhǔn)曲線法是以標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣單位量(U)為橫坐標(biāo)，溶圈面積為縱坐標(biāo)求回歸方程，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品的效價(jià)。
3方法學(xué)考察
3.1專屬性試驗(yàn)
按供試品溶液制備方法制備不加樣品的陰性對(duì)照溶液，即空白溶液，采用上述方法測定效價(jià)。陰性對(duì)照樣品未出現(xiàn)溶液溶圈。證明在本法條件下，陰性對(duì)照無干擾。
3.2耐用性試驗(yàn)
3.2.1不同凝血酶不同凝血酶對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響
分別用兩個(gè)批號(hào)凝血酶(牛血)鋪板，按照效價(jià)方法測定2批地龍的效價(jià)。不同凝血酶對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，說明不同批號(hào)的凝血酶對(duì)本法測定無明顯影響。
3.2.2不同纖維蛋白原對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響
分別用兩個(gè)批號(hào)纖維蛋白原鋪板，按照效價(jià)方法測定2批地龍的效價(jià)。說明不同批號(hào)的纖維蛋白原對(duì)本法測定無明顯影響。
3.3線性范圍
取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品加0.9%氯化鈉注射液制成每1μL含蚓激酶為10、2.5、0.625U的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取上述10U·μL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液40、20、10μL和上述2.5U·μL-1、0.625U·μL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL、20μL點(diǎn)樣，測定溶圈面積。以點(diǎn)樣量(U)為橫坐標(biāo)，溶圈面積為縱坐標(biāo)求得回歸方程:Y=0.9824X+97.651R2=0.9531點(diǎn)樣量在12.5～400U范圍內(nèi)。
3.4準(zhǔn)確度試驗(yàn)
采用加樣回收法測定。取已知含量樣品(批號(hào)20111001，效價(jià)898U·mg-1)，稱取6份，(每份約0.5g)，分別精密稱定，再精密量取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品200502，效價(jià)100U·μL-1)800μL分別加入樣品中，按供試品溶液制備方法制備，并按本文中效價(jià)測定方法檢測，回收率計(jì)算方法為(測量效價(jià)-樣品效價(jià))/標(biāo)準(zhǔn)品加入量×100%。本法回收率為86.16%，RSD為9.65%。
3.5精密度試驗(yàn)
取供試品溶液(批號(hào)為20111001)，連續(xù)點(diǎn)樣5板，測定效價(jià)。測定精密度試驗(yàn)RSD為0.98%。
3.6熱穩(wěn)定性考察
取4批地龍樣品，提取液采用不同溫度30、40、50、60、70、80、90℃溫度水浴20min后，按溶栓圈直徑乘積進(jìn)行纖溶圈大小比較。提取溫度為30～60℃，效價(jià)基本穩(wěn)定，70℃時(shí)效價(jià)降低，80℃以上則樣品基本喪失活性。說明溫度對(duì)樣品效價(jià)有明顯影響，所以在生產(chǎn)，儲(chǔ)存，提取時(shí)采用不加熱超聲，并且提取過程應(yīng)避免溫度過高。
4對(duì)不同來源不同炮制的地龍生物效價(jià)的考察
取收集的不同來源的地龍樣品，按制定的蚓激酶生物效價(jià)測定法進(jìn)行效價(jià)測定。可見不同來源、不同炮制方法、儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)中藥地龍的蚓激酶生物效價(jià)差異很大。
5討論
5.1纖溶生物活性測定法
地龍含有酶類、蛋白質(zhì)、多脂類、氨基酸、微量元素和其他成分等，具有通絡(luò)，活血化瘀功效，用于關(guān)節(jié)痹痛、肢體麻木、半身不遂等。現(xiàn)代研究表明:地龍?bào)w內(nèi)溶栓成分主要有多種溶纖酶和十幾種激酶。研究證明蚓激酶在體外具有很強(qiáng)的纖溶活性，故本品采用體外纖維蛋白平板法測定其纖溶生物活性。
5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定效價(jià)
現(xiàn)報(bào)道地龍纖溶生物活性測定法多采用蚓激酶效價(jià)測定法，有量反應(yīng)平行法，還有采用單點(diǎn)法測量溶圈直徑或面積來計(jì)算。前者一般原則為標(biāo)準(zhǔn)品和樣品為同質(zhì)，考慮地龍可能除了含有蚓激酶具有溶纖的成分外，還含有多種溶纖酶和激酶、蛋白質(zhì)等其他成分，故沒有采用量反應(yīng)平行法。后者單點(diǎn)法測定其效價(jià)，結(jié)果受試劑如纖維蛋白和凝血酶、點(diǎn)樣誤差、平板制備等多種因素影響，重現(xiàn)性較差。故本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定其纖溶生物效價(jià)，可以有效地控制實(shí)驗(yàn)誤差。
5.3對(duì)炮制工藝考察
炮制工藝采用冷凍干燥、40度干燥、室溫陰干等三種方法進(jìn)行考察、結(jié)果冷凍干燥工藝地龍?bào)w外纖溶生物效價(jià)最高，其次低溫干燥(40℃)、室溫陰干，其余曬干的樣品效價(jià)均遠(yuǎn)低于前者，因此如果地龍用于活血通絡(luò)時(shí)，炮制方式首選凍干處理，其次為室溫陰干和低溫干燥，如果需低溫干燥時(shí)，生產(chǎn)關(guān)鍵參數(shù)溫度需控制在40℃以下為宜。
5.4熱穩(wěn)定性考察
隨著溫度的升高，地龍纖溶生物活性呈下降趨勢，但在60℃以下較穩(wěn)定，提示在炮制、中藥提取和儲(chǔ)運(yùn)過程中應(yīng)嚴(yán)格控制注意溫度。
6小結(jié)
本實(shí)驗(yàn)建立的地龍蚓激酶生物效價(jià)檢測方法操作簡單，專屬性強(qiáng)，耐用性良好，能有效評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地，不同炮制方法地龍的纖溶生物活性。樣品檢測結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地，不同炮制方法的地龍纖溶生物效價(jià)差異很大，雖有些產(chǎn)地來源的地龍無法獲取具體的炮制工藝參數(shù)，但從生產(chǎn)批號(hào)可以推測隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長，生物活性呈下降趨勢，2016年生產(chǎn)的地龍生物效價(jià)低于檢出限。本品為動(dòng)物源藥材，主要含有多種酶、蛋白和氨基酸等成分，應(yīng)對(duì)中藥材前處理、提取、貯運(yùn)過程中的溫度進(jìn)行控制。
本實(shí)驗(yàn)采用體外纖溶生物活性評(píng)價(jià)不同來源不同炮制的地龍質(zhì)量，前期本實(shí)驗(yàn)室對(duì)其體內(nèi)體外藥效相關(guān)性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示具有良好的相關(guān)性，因此體外纖溶生物活性測定法是用于評(píng)價(jià)地龍?zhí)崛±w溶成分工藝穩(wěn)定性和可行性的一種有效的手段。但此方法僅限于對(duì)于地龍臨床用于通絡(luò)活血類的病癥的評(píng)價(jià)。鑒于地龍除了具有通絡(luò)活血化瘀的作用外，還具有清熱定驚，平喘，利尿等功效。目前階段對(duì)于此方面功效成分和生物活性相關(guān)性有待于進(jìn)一步研究。
參考文獻(xiàn)
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中藥方向論文投稿刊物：《中藥材》(月刊)創(chuàng)刊于1978年，由國家藥品監(jiān)督管理局主管，國家藥品監(jiān)督管理局中藥材信息中心站主辦。主要報(bào)道中藥材的種(養(yǎng))技術(shù)(GAP)，資源開發(fā)和利用，藥材的加工炮制與養(yǎng)護(hù)，鑒別，成分，藥理，臨床，制劑，用藥等方面的研究論文。
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