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摘 要： 本研究采用PCR技術對采自廣州附近海域的斑點馬鮫，19個個體的線粒體DNAD-loop基因進行擴增和分析，結果表明，該斑點馬鮫群體的遺傳多樣性較為豐富，19個個體通過聚類形成2大分支，表明該群體可能來源于2個不同的母系祖先。
關鍵詞：遺傳多樣性; 斑點馬鮫; 線粒體DNA
斑點馬鮫屬鯖科馬鮫屬，是暖水性魚類，是我國南海區(qū)重要的經(jīng)濟魚類。目前尚無關于斑點馬鮫群體遺傳多樣性的研究報道。線粒體DNA控制區(qū)是整個mtDNA序列和長度變異最大的區(qū)域，被廣泛應用于魚類種群遺傳學研究。本研究利用相應的引物對分布于南海的斑點馬鮫的控制區(qū)部分序列進行了PCR 擴增和序列測定，分析該斑點馬鮫群體的遺傳多樣性，以期為制定合理的斑點馬鮫資源增殖和保護措施提供科學依據(jù)。
1 材料和方法
1.1實驗材料 斑點馬鮫樣品于2007年6月取自廣州，冷凍或新鮮樣品運回實驗室，取背部肌肉保存于95.0%酒精中。
1.2 實驗方法 按傳統(tǒng)法(酚/氯仿抽提法)從肌肉中提取基因組DNA，將提取DNA溶解于超純水中，置4ºC保存。用于擴增控制區(qū)的擴增引物為：DL-：5’-CTGGAAAGAACGCCCGGCATG-3’。PCR反應體積為25 µL，其中包括50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH8.3，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 200 µmol/L，Ex Taq酶1.25 units，引物0.2 mmol/L，模板DNA 1µL，加滅菌蒸餾水至25 µL。PCR反應在Eppendorf Mastercycler 5333擴增儀上進行。PCR反應條件為：94℃預變性3 min，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃45s，50℃45s，72℃ 1 min，最后72℃延伸10 min。以上反應均用陰性對照來檢查是否有DNA污染。取1.5 µL擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用小量膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)進行PCR產(chǎn)物回收和純化，回收產(chǎn)物由上海桑尼生物科技有限公司經(jīng)ABI公司3730 型全自動序列分析儀進行測序。
1.3 數(shù)據(jù)分析 用DNASTAR軟件進行排序，并結合人工校正。通過MEGA(molecular evolutionary genetics analysis, Kumar 等，1993)軟件統(tǒng)計所測序列的堿基組成，并計算出不同個體間的遺傳距離，并構建NJ系統(tǒng)樹。用DNASP(DNA Sequences Polymorphism)軟件進行單倍型多樣度(HD)、核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(K)等遺傳多樣性參數(shù)的計算。
2 結果
2.1 目的片段的PCR擴增及序列測定 本實驗共測定了斑點馬鮫的19個個體的mtDNA D-loop基因片段，其堿基序列為514bp，A、T、C、G 4種堿基在19個個體中的平均含量分別為35.5%(35.2%-35.8%)、30.6%(30.1%-30.9%)、19.4%(19.1%-19.7%)、14.5%(14.2%-15.0%)，AT含量(66.1%)高于GC含量(33.9%),其堿基的平均含量與藍點馬鮫比較相似。斑點馬鮫mtDNA-loop基因的AT含量(66.1%)與藍點馬鮫(68.2%)、太平洋鯖魚D-loop基因的AT含量(63.8%)非常接近，這也符合脊椎動物mtDNA D-loop區(qū)域堿基組成的特點。
2.2 變異位點的分布 31個變異位點在19條斑點馬鮫D-1oop序列中的分布如表1所示，其中簡約信息位點為8個，它們分別位于第18、24、80、196、217、277、384、442位，其余的23個為單態(tài)信息位點。從表中還可以看出，19個個體的序列除2號和8號魚序列相同外，其他個體都不完全相同，即19個個體共有18種單倍型，單倍型多樣度為0.994，核苷酸多樣度為0.00798。514 bp長度的核苷酸序列中共存在3個堿基插入(24、180、494)，20個轉換位點(A-G、C-T)，5個顛換位點(位點8、34、282、488、491)及3個轉換與顛換同時存在的位點(位點197、198、483)。
2.3 斑點馬鮫不同個體間的遺傳距離 應用MEGA2軟件，根據(jù)D-loop序列算出了19個個體間的Kimura遺傳距離，19個個體中，除了SG2和SG8之間的遺傳距離為0.0000，其他任何2個個體間的遺傳距離均不為0.000，故共有18種單倍型;19個個體中SG.12與SG.14的遺傳距離遺傳距離最大為0.0179;19個個體間的堿基差異數(shù)在0～9之間。
表1 變異位點在19條斑點馬鮫D-loop序列中的分布
2.3 NJ系統(tǒng)樹的構建 以19個個體的控制區(qū)序列構建的NJ系統(tǒng)樹分別如圖1所示。從圖中可以看出，2種方法得到的系統(tǒng)樹的拓撲結構相似，19個個體形成了2大分支。線粒體DNA屬于母系遺傳，可推斷該群體的19個個體可能來源于2個不同的母系祖先。
圖1 由控制區(qū)序列得到的NJ系統(tǒng)樹
3 討論
在19個藍點馬鮫個體中檢測到18個單倍型，單倍型多樣度為0.994，核苷酸多樣度為0.00798。本研究從控制區(qū)序列獲得的群體遺傳多樣性參數(shù)和個體間的遺傳距離都表明了，斑點馬鮫南海水域群體目前的遺傳多樣性非常豐富。這種現(xiàn)象一方面與種類差異有關;另一方面，可能與斑點馬鮫的棲息地多樣性、活動范圍大有關。因為斑點馬鮫有廣泛分布于南海水域的產(chǎn)卵場、索餌場和越冬場，并作長距離洄游。此外，斑點馬鮫不同于梭魚等其它增養(yǎng)殖魚類，尚未受到由于種苗培養(yǎng)而導致的近交等方面的影響，因而具有較豐富的遺傳多樣性。
閱讀范文：醫(yī)學核心論文投稿住院醫(yī)師規(guī)范化培訓
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〔關鍵詞〕住院醫(yī)師培訓;實施現(xiàn)狀;對策;醫(yī)學教學
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