谷子 SiPSY1 基因與米色形成相關(guān)性分析

　　摘 要：為明確谷子八氫番茄紅素合成酶基因與谷子米色形成的相關(guān)性，本研究從黃色和白色 2 種不同 米色谷子中克隆出 SiPSY1 基因的 cDNA 全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法檢測(cè)該基因在谷子米色形成過(guò)程中的表達(dá)模式。 結(jié)果表明，SiPSY1 基因編碼序列(CDS)全長(zhǎng) 為 1 248 bp，共編碼 415 個(gè)氨基酸。 SiPSY1 蛋白的理論分子量為 46􀆰 866 kDa，等電點(diǎn)為 8􀆰 97，為不穩(wěn)定 親水性蛋白。 該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由 α 螺旋(57􀆰 35%) 、不規(guī)則卷曲(29􀆰 64%) 、延伸鏈結(jié)構(gòu)(9􀆰 88%)和 β 轉(zhuǎn)角(3􀆰 13%)四種結(jié)構(gòu)組成。 SiPSY1 蛋白與玉米 ZmPSY1 的同源性較高，二者的親緣關(guān)系較近。 在谷 子米色形成的初期和中期，黃色米色品種籽粒中 SiPSY1 基因的表達(dá)水平顯著高于白色米色品種，而在 米色形成后期，該基因在白色米色品種中的表達(dá)水平顯著提高，并高于在黃色米色品種中的表達(dá)水平。 隨著籽粒成熟米色的形成，SiPSY1 基因在黃色米色品種七月黃中的表達(dá)量呈先上升后顯著下降的趨 勢(shì)，在白色米色品種中呈逐漸上升的趨勢(shì)。 通過(guò)對(duì) SiPSY1 基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特性的分析，初步推測(cè)谷子 米色差異及形成與 SiPSY1 基因結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)，而與基因的表達(dá)特性有一定的相關(guān)性。 本研究結(jié)果為進(jìn)一步 闡明 SiPSY1 基因的功能以及谷子米色形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞：谷子; 米色; SiPSY1 基因; 基因克隆; 表達(dá)模式

　　類胡蘿卜素是一種天然色素，常積累于高等植物 花、果實(shí)的成色母細(xì)胞中，使其表現(xiàn)出黃色、紅色或橙 色。 此外，類胡蘿卜素也是某些植物根和種子中的重 要色素[1] 。

　　類胡蘿卜素在植物光合作用及光保護(hù)作 用中具有重要作用[2-3] ，在增強(qiáng)人體免疫、延緩衰老、 預(yù)防心血管慢性疾病以及防癌抗癌方面也具有重要功 效[3-5] 。 類胡蘿卜素作為重要的功能性成分受到廣泛 關(guān)注。 目前，類胡蘿卜素生物合成途徑已基本明確，是類 異戊二烯代謝體系中的一個(gè)分支，過(guò)程包括縮合、脫 氫、環(huán)化、羥基化以及環(huán)氧化反應(yīng)[6] 。

　　在類胡蘿卜素 生物合成途徑中，多種酶發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中，八氫番 茄紅素合成酶( phytoene synthase， PSY)是第一個(gè)限速 酶，可 催 化 兩 分 子 牻 牛 兒 基 牻 牛 兒 基 二 磷 酸 (geranylgeranyl diphosphate， GGPP ) 產(chǎn)生第一個(gè)類胡 蘿卜素分子———八氫番茄紅素[6-8] 。 研究者已利用cDNA 3′ 末 端 快 速 擴(kuò) 增 技 術(shù) ( rapid amplification of cDNA 3′ ends， 3′ RACE ) 、 逆轉(zhuǎn)錄 - 聚合酶鏈反應(yīng) ( reverse transcription⁃polymerase chain reaction， RT⁃ PCR) 等 技 術(shù) 在 玉 米[9] 、 擬 南 芥[10-11] 、 番 茄[12] 、 油 菜[13] 、小麥[14] 、枸杞[15] 、甘薯[16] 、雞爪槭[17] 等植物中 分離克隆了 PSY 基因，對(duì)基因的序列特征開(kāi)展了一系 列生物信息學(xué)分析[18-19] ，并通過(guò)超表達(dá)載體的構(gòu)建對(duì) 該基因在多種植物中的功能進(jìn)行了研究，獲得了一些 具有特殊顏色的轉(zhuǎn)基因植物，如胚呈橙黃色的轉(zhuǎn)基因 油菜[20] 、胚乳呈金黃色的“金大米” [21]等。

　　谷子[ Setaria italica( L.) Beauv] 是我國(guó)北方重要 的雜糧作物，去殼后的小米具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，深受 消費(fèi)者的青睞，而米色是評(píng)價(jià)小米品質(zhì)的重要指標(biāo)。 小米中富含類胡蘿卜素，平均含量為 1􀆰 2 mg·kg-1 ，是 玉米的 2 倍[22] 。 從不同米色品種的小米中提取黃色 素，并進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)米色與類胡蘿卜素的成分及含量具有一定的相關(guān)性[23-24] ，但目前關(guān)于米色形成的 分子機(jī)制仍不明確，且對(duì)控制谷子類胡蘿卜素生物合 成關(guān)鍵酶基因及其功能的研究較少。

　　基于此，本研究 以不同米色谷子為試驗(yàn)材料，分離克隆了 SiPSY1 的 cDNA 全長(zhǎng)，通過(guò)對(duì)基因結(jié)構(gòu)以及該基因在谷子米色 形成過(guò)程中表達(dá)特性差異的分析，初探 SiPSY1 基因與 谷子米色形成的相關(guān)性，以期為進(jìn)一步開(kāi)展谷子類胡 蘿卜素調(diào)控機(jī)制的研究以及明確谷子米色形成分子機(jī) 制提供理論依據(jù)。

　　1　 材料與方法

　　1􀆰 1　 材料種植及取材

　　選擇黃色(七月黃、三變黃)和白色(白谷白米谷、 白米糙)2 種不同米色品種的谷子為試驗(yàn)材料，材料均 為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所谷子課題組收集的農(nóng)家 種，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所試驗(yàn)田，試驗(yàn)田肥 力均勻，地勢(shì)平坦。 采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置 3 次 重復(fù)。 行長(zhǎng) 3 m，行距 40 cm， 三行區(qū)。 取材時(shí)，各品 種每個(gè)重復(fù)選擇中間行 3 株生長(zhǎng)一致健康植株的籽粒進(jìn)行混合，用鑷子快速準(zhǔn)確地剝下相同灌漿狀態(tài)下的 籽粒，在液氮中速凍后于-80℃低溫保存。 3 個(gè)取樣時(shí) 期分別為：S1(米色形成初期，胚乳呈粉狀) ，S2(米色 形成中期，胚乳質(zhì)地硬化) ，S3(米色形成后期，籽粒成 熟) 。

　　1􀆰 2　 總 RNA 提取和 cDNA 合成 將低溫保存的籽粒取出，去殼后置于液氮中研磨 成粉末，參照 EZ-10 Total RNA Mini⁃Preps Kit RNA 提 取試劑盒(上海生工生物) 說(shuō)明書(shū)提取籽粒總 RNA， RNA 濃度及質(zhì)量分別通過(guò) Nanodrop 2000c 超微量核 酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)賽默飛)和 1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn) 行檢測(cè)。 cDNA 合成按照 M⁃MuLV 第一鏈 cDNA 合成 試劑盒(上海生工生物) 說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行，獲得的 cDNA 利用內(nèi)參引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證。

　　1􀆰 3　 引物設(shè)計(jì) 參考玉米 ZmPSY1 基因序列，在谷子基因組數(shù)據(jù) 庫(kù)中查找同源性最高的基因序列，分別以 cDNA 和 CDS 序列為模板，利用 Primer 5 軟件設(shè)計(jì)克隆引物和 定量引物，其中 SiActin 是內(nèi)參基因。 引 物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

　　1􀆰 4　 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序 以上述獲得的谷子籽粒 cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增 SiPSY1 基因 cDNA 全長(zhǎng)。 采用 50 μL 反應(yīng)體系，PCR 程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 2􀆰 5 min;95℃變性 15 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán);72℃ 延伸 10 min 后 4℃保存。 利用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并分離 PCR 產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收后送至 上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

　　1􀆰 5　 生物信息學(xué)分析 利用 DNAMAN 軟件進(jìn)行序列開(kāi)放閱讀框的翻譯、 同源性比對(duì)以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，通過(guò) ProtParam 網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì) 理化 特 性 分 析， 分 別 采 用 SOPMA 和SWISS⁃MODEL 在線 網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，應(yīng)用 MultAlin 網(wǎng)站進(jìn)行多序列比對(duì)。

　　1􀆰 6 　 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR ( quantitative real⁃time PCR， qRT⁃PCR) 使用 SGExcel FastSYBR qPCR 預(yù)混液(含 ROX) 試劑盒進(jìn)行 qRT⁃PCR，采用 50 μL 反應(yīng)體系：25 μL 2× SGExcel FastSYBR Mixture(含 ROX) ， 2 μL cDNA，上、 下游引物(10 μmol·L-1 )各 1 μL，最后加入 RNase⁃Free ddH2O 至 50 μL。

　　使用 CFX96 TouchTM熒光定量 PCR 檢測(cè)系統(tǒng) ( 美國(guó)伯樂(lè)) ，反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃ 預(yù)變性 3 min;95℃變性 5 s，60℃ 退火 20 s，40 個(gè)循環(huán)。 每個(gè)反 應(yīng)設(shè)置 3 次技術(shù)重復(fù)。 采用 2 -ΔΔCT 法，通過(guò) Bio⁃RadCFX Manager 3􀆰 1 軟件計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。 利用 SPSS 17􀆰 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

　　2　 結(jié)果與分析

　　2􀆰 1　 SiPSY1 基因的克隆與序列差異分析

　　以黃色和白色 2 種不同米色谷子為材料，提取籽 �？� RNA，進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以 cDNA 為模板， 通過(guò) PCR 擴(kuò)增獲得了約 1 500 bp 的目標(biāo)片段 。 將產(chǎn)物送至公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)不同品種 SiPSY1 基因的 編碼序列(coding sequence， CDS)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基 因序列在不同品種間無(wú)差異 ，說(shuō)明其在不同品 種中編碼相同的氨基酸。 利用 DNAMAN 軟件對(duì)基因 序列進(jìn)行翻譯，結(jié)果表明 SiPSY1 基因 CDS 全長(zhǎng)為 1 248 bp， 共編碼 415 個(gè)氨基酸 。

　　2􀆰 2　 SiPSY1 基因生物信息學(xué)分析

　　2􀆰 2􀆰 1　 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 利用 ProtParam 在線 分析 SiPSY1 的氨基酸序列，結(jié)果表明其理論分子量為 46􀆰 866 kDa，等電點(diǎn)為 8􀆰 97，分子式為 C2072 H3308 N592 O605 S21 ，構(gòu)成該蛋白的氨基酸中，亮氨酸含量最高，占 11􀆰 6%，其次為丙氨酸和精氨酸，均占 9􀆰 9%，組氨酸含 量最低，僅為 0􀆰 5%。 不穩(wěn)定系數(shù)為 62􀆰 61，屬于不穩(wěn) 定蛋 白。 其 親 水 性 平 均 系 數(shù) ( grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0􀆰 284，屬于親水性蛋白。

　　2􀆰 2􀆰 2　 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用 SOPMA 網(wǎng)站在線預(yù) 測(cè) SiPSY1 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，該蛋 白質(zhì)由 α 螺旋(238 個(gè)氨基酸殘基，占 57􀆰 35%) 、不規(guī) 則卷曲(123 個(gè)氨基酸殘基，占 29􀆰 64%) 、延伸鏈結(jié)構(gòu) (41 個(gè)氨基酸殘基，占 9􀆰 88%)和 β 轉(zhuǎn)角(13 個(gè)氨基酸殘基，占 3􀆰 13%)構(gòu)成。 通過(guò) SWISS⁃MODEL 網(wǎng)站獲得 了 SiPSY1 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，與二 級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

　　2􀆰 2􀆰 3　 同源序列與系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用 DNAMAN 軟 件對(duì)克隆獲得的谷子 SiPSY1 氨基酸序列與 NCBI GeneBank 中其他植物的 PSY1 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)， 分析了它們的同源性和進(jìn)化關(guān)系。

　　谷子 SiPSY1 編碼氨基酸與多種植物 PSY1 編碼氨基酸具有 同源性，有多個(gè)保守區(qū)域，其中，與玉米 ZmPSY1 的同 源性最高，達(dá)到 84􀆰 77%，其次為水稻 OsPSY1，同源性 為 77􀆰 5%，與小麥 TaPSY1 的同源性為 73􀆰 86%，此外， 與擬南芥 AtPSY1、辣椒 CaPSY1 的同源性相同，均為 62􀆰 95%，與番茄 SlPSY1、木薯 MePSY1 和油菜 BnPSY1 的同源性相同，為 62􀆰 73%。 基于以上多重序列比對(duì)結(jié)果，進(jìn)一步構(gòu)建了系統(tǒng) 進(jìn)化 樹(shù) ， 結(jié) 果 表 明， 谷 子 SiPSY1 與 玉 米 ZmPSY1 的親緣關(guān)系最近，與另外 2 個(gè)禾本科作物水 稻和小麥的 PSY1 親緣關(guān)系次之，而與其他植物的 PSY1 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

　　2􀆰 3　 SiPSY1 基因在不同谷子品種米色形成過(guò)程中 的表達(dá)特性分析 通過(guò) qRT⁃PCR 的方法，測(cè)定分析了 SiPSY1 基因 在不同米色谷子品種中的表達(dá)差異以及在谷子米色形 成過(guò)程中表達(dá)水平的變化情況，。

　　SiPSY1 基因在谷子籽粒中的相對(duì)表達(dá)量存在品種差異，具體 表現(xiàn)為，在米色形成初期( S1)和中期( S2) ，SiPSY1 基 因在 2 個(gè)黃色米色品種中的表達(dá)水平均顯著高于在白 色米色品種中的表達(dá)水平。 在米色形成后期( S3) ， SiPSY1 基因在 2 個(gè)白色米色品種中的表達(dá)水平，高于 在黃色米色品種中的表達(dá)水平。 在谷子米色形成過(guò)程中，SiPSY1 基因在黃色米色 品種七月黃中的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為先上升后顯著下降 的趨勢(shì)，在三變黃中呈下降趨勢(shì)，但 3 個(gè)時(shí)期的變化并 不顯著。 而在 2 個(gè)白色米色品種中，SiPSY1 的相對(duì)表 達(dá)量均表現(xiàn)為逐漸上升的趨勢(shì)，其中，在白谷白米谷米 色形成后期( S3) ，表達(dá)量顯著升高，在白米糙米色形 成各時(shí)期的變化均達(dá)到顯著水平 。

　　3　 討論

　　在植物 類 胡 蘿 卜 素 生 物 合 成 途 徑 中， 兩 分 子 GGPP 在八氫番茄紅素合成酶( PSY)作用下生成第一 個(gè)類胡蘿卜素分子———八氫番茄紅素。 PSY 作為第一 個(gè)限速酶，其編碼基因成為研究類胡蘿卜素生物合成機(jī)制以及利用基因工程技術(shù)提高植物類胡蘿卜素含量 的首選目的基因[25] 。

　　目前，在多種植物中已經(jīng)成功克 隆分離出 PSY 基因，并鑒定出 PSY 基因家族中的 3 個(gè) 成員，分別為 PSY1、PSY2 和 PSY3，3 個(gè)基因具有器官 或質(zhì)體表達(dá)特異性。 其中，PSY1 主要在含有有色體的 花、果實(shí)和種子中調(diào)控類胡蘿卜素的合成[25-28] 。 本研 究以不同米色谷子品種籽粒為研究材料，利用同源克 隆技術(shù)，獲得了谷子 SiPSY1 基因的 cDNA 全長(zhǎng)，其開(kāi) 放閱讀框( open reading frame， ORF) 包含 1 248 個(gè)堿 基，共編碼 415 個(gè)氨基酸。 谷子 SiPSY1 蛋白與同屬于 C4 禾 本 科 作 物 玉 米 的 ZmPSY1 同 源 性 最 高， 為 84􀆰 77%，二者親緣關(guān)系最近。

　　4　 結(jié)論

　　本研究從黃色和白色兩種不同米色谷子籽粒中克隆出 SiPSY1 基因的 cDNA 全長(zhǎng)序列，該基因的 CDS 全 長(zhǎng)為 1 248 bp，共編碼 415 個(gè)氨基酸。 通過(guò) qRT⁃PCR 分析表明，在谷子米色形成初期和中期，SiPSY1 基因 在黃色米色品種籽粒中的表達(dá)水平顯著高于白色米色 品種，由此推測(cè)谷子 SiPSY1 基因的表達(dá)特性與谷子米 色形成具有一定的相關(guān)性。

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　　作者：禾 璐1，2 賈蘇卿1 趙芳玉1 劉 晶2 張 彬2 侯思宇2 韓淵懷2，∗

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