數(shù)字PCR技術的文獻計量及可視化分析

　　[摘要]目的利用文獻計量學研究方法，解析數(shù)字PCR技術相關文獻的分布模式和知識結構。方法應用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫檢索2000年1月1日至2019年12月31日已發(fā)表的有關數(shù)字PCR的學術論文。利用書目條目共現(xiàn)矩陣生成器(BICOMB)，對提取的主題詞進行定量分析。根據(jù)生成的高頻主要主題詞/副主題詞詞篇矩陣，利用gCluto軟件進行聚類分析。構建主要主題詞/副主題詞的共現(xiàn)矩陣，進行戰(zhàn)略坐標及社會網(wǎng)絡關系分析。結果根據(jù)檢索策略，共納入2733篇論文，年度論文發(fā)表呈現(xiàn)顯著上升趨勢。在所提取的主題詞中，識別出25個高頻主題詞/副主題詞，并將熱點聚類為5類。在戰(zhàn)略坐標圖中，數(shù)字PCR技術在肺癌突變基因快速檢測及原癌基因突變檢測方法的建立與臨床應用方面的研究處于成熟且核心位置，而在婦科腫瘤檢測應用、無創(chuàng)產(chǎn)前檢查以及液體活檢等方面處于相對不成熟階段，為日后的研究提供了潛在的研究空間。結論通過對近20年的數(shù)字PCR技術的文獻計量學研究，可以對這一技術的發(fā)展趨勢和相關應用進行總體把握，為研究人員的項目實際和運行提供借鑒。

　　[關鍵詞]數(shù)字PCR;文獻計量學;共詞分析;戰(zhàn)略坐標;社會關系網(wǎng)絡分析

　　數(shù)字PCR(digitalpolymerasechainreaction，dPCR)技術是20世紀90年代發(fā)展起來的新一代聚合酶鏈反應擴增技術[1]。經(jīng)過十幾年的不斷探索與應用，數(shù)字PCR技術因其能實現(xiàn)對初始樣本的絕對定量、高靈敏性、高特異性和高精確度等特點，廣泛應用于基因檢測、疾病診斷、環(huán)境及食品監(jiān)測等方面。文獻計量學方法，如詞性分析和共詞分析等，可對文獻中熱點問題進行定量分析與解讀[2]。

　　根據(jù)選定文獻可用一組專業(yè)詞匯來表示的原則，在分析過程中，兩個相關的專業(yè)詞匯之間的關系由它們在同一篇文獻中共存的頻率來定義[3]。然后，應用聚類分析等統(tǒng)計分析方法對詞匯進行分類，進而分析出所選研究的重點和框架[4]。此外，根據(jù)共現(xiàn)聚類分析結果，可計算出每個聚類中關鍵詞的密度和向心度，繪制戰(zhàn)略坐標圖，對所選研究領域的發(fā)展趨勢，潛在研究方向作出描述。社會網(wǎng)絡分析(socialnetworkanalysis，SNA)是研究一組因素之間的關系并分析其網(wǎng)絡聯(lián)系的方法，它包括節(jié)點(在本研究中表示提取的主要主題詞/副主題詞)和連線(在本研究中表示這些主題詞之間的關系)[5]。

　　在復雜網(wǎng)絡中，識別影響節(jié)點具有重要的理論和實踐意義。中心度是分析社會網(wǎng)絡的一種重要度量方法，其中點度中心度、中間中心度和接近中心度是比較網(wǎng)絡中節(jié)點中心性的3個被廣泛接受的指標[6]。本研究結合文獻計量學、戰(zhàn)略坐標分析和社會關系網(wǎng)絡分析的優(yōu)勢，就dPCR技術近20年的文獻報道情況及熱點研究領域進行了分析。

　　1數(shù)據(jù)來源與方法

　　1.1數(shù)據(jù)來源

　　本研究以PubMed數(shù)據(jù)庫為基礎，以((((((("digitalpolymerasechainreaction"Title/Abstract)OR("digitalPCR"Title/Abstract))OR("DPCR"Title/Abstract))OR("dropletdigitalpolymerasechainreaction"Title/Abstract))OR("dropletdigitalPCR"Title/Abstract))OR("ddpcr"Title/Abstract))OR("chipdigitalpolymerasechainreaction"Title/Abstract))OR("chipdigitalPCR"Title/Abstract)為檢索式，時間限定為2000年1月1日至2019年12月31日。從PubMed下載的每份文獻包含以下項目：標題、作者、出版年份和主要主題詞/副主題詞。這些數(shù)據(jù)保存為TXT格式供后續(xù)分析。

　　1.2方法

　　1.2.1數(shù)據(jù)提取與矩陣設置

　　書目條目共現(xiàn)矩陣生成器(bibliographicitemco⁃occurrencematrixbuilder，BICOMB)，可在數(shù)據(jù)庫中精準提取和統(tǒng)計書目信息，生成詞篇矩陣及共現(xiàn)矩陣，為后續(xù)統(tǒng)計分析提供基礎數(shù)據(jù)[7]。

　　在本研究中，利用該軟件對收集文獻的年份、作者、主要主題詞/副主題詞等信息進行頻率排序。H指數(shù)原則，即將需要詞條根據(jù)出現(xiàn)頻次升序排序，當出現(xiàn)頻次與排序序號相一致時記為H指數(shù)[8]。在本研究中以dPCR為研究對象，提取的高頻主題詞中有“PolymeraseChainReaction”等主題詞掩蓋了檢索結果中真實應用的其他主題詞，“DNA/*analysis”“DNA/*genetics”范圍過于寬泛，指向性較差。

　　因此，在統(tǒng)計時將這些主題詞剔除，重新得到高頻主題詞/副主題詞列表。根據(jù)高頻主題詞在同一篇文章共現(xiàn)情況，構建以主要主題詞/副主題詞為行名、源文獻為列名的主題詞⁃源文獻詞篇矩陣，利用gCluto(graphicalCLUsteringtoolkit，devel⁃opedbyRasmussen，Newman，andKarypisfromUni⁃versityofMinnesota)，Version1.0軟件建立雙聚類分析模型[7]。同時構建高頻主題詞共現(xiàn)矩陣，進行戰(zhàn)略坐標分析及社會網(wǎng)絡分析。

　　1.2.2戰(zhàn)略坐標分析

　　根據(jù)高頻主題詞共現(xiàn)情況計算出每個聚類類別的向心性和密度，繪制二維空間坐標圖[9]。X軸代表向心性或外部銜接指數(shù)，即主題詞在整個網(wǎng)絡中的核心位置。Y軸代表密度或 內部凝聚力指數(shù)，即主題詞在整個網(wǎng)絡中的發(fā)展情況[10]。在X軸和Y軸上生成4個象限，根據(jù)各個聚類類別在象限中的位置，描述聚類類別在該領域的核心位置及發(fā)展情況。

　　1.2.3社會關系網(wǎng)絡分析

　　將高頻主題詞共現(xiàn)矩陣導入Ucinet6.0(UniversityofCalifornia，Irvine，USA)軟件，采用社會網(wǎng)絡分析方法對dPCR的主題詞和知識結構進行分析[11]。

　　利用NetDraw2.084軟件將主題詞進行網(wǎng)絡結構可視化處理，使其顯示在二維圖上。網(wǎng)絡節(jié)點是主要主題詞/副主題詞標簽，連線表示這些詞的共現(xiàn)頻率。為了解dPCR主題詞的網(wǎng)絡結構，我們通過測量每個節(jié)點的點度中心度、中間中心度和接近中心度來評估這些關鍵詞在網(wǎng)絡中的位置。點度中心度表示網(wǎng)絡圖的整體中心性，體現(xiàn)整體網(wǎng)的集中程度。中間中心度表示該點的“中間人”程度，即媒介程度。接近中心度被定義為一個節(jié)點到所有其他節(jié)點的最短距離的和，意味著接近中心度越高，該節(jié)點與其他節(jié)點的距離就越近。

　　2結果

　　2.1文獻基本情況

　　根據(jù)檢索策略，本研究共納入2733篇文獻。自2012年開始，關于dPCR技術的報道呈顯著上升趨勢。本研究中共有918種期刊報道過dPCR技術相關文獻，其中發(fā)表量前十的期刊中，前3位期刊PLoSOne、ScientificReports和MethodsinMo⁃lecularBiology發(fā)文數(shù)占該領域檢索文獻總數(shù)10.53%。

　　2.2研究熱點聚類及聚類分析

　　在檢索到的2733篇文獻中，累計出現(xiàn)主要主題詞/副主題詞3363個。主題詞出現(xiàn)頻次與排序相交處在24~25，取24為本研究的H指數(shù)，進而定義出現(xiàn)頻次≥24次的主題詞為高頻主題詞。根據(jù)H指數(shù)原則提取出25個高頻主題詞。

　　25個高頻主題詞出現(xiàn)頻次的累計百分比為15.47%。這些詞可代表近20年dPCR領域的研究熱點。在文獻篇名與主要主題詞/副主題詞雙聚類分析基礎上，對主題詞進行分組，共得5個聚類分組。由聚類分組可視化圖形可見，5組區(qū)域相互獨立，其中類別1聚集性最好，表明類別1內部主題詞與該研究領域具有很高的一致性。

　　2.3dPCR社會關系網(wǎng)絡分析

　　使用點度中心度、中間中心度和接近中心度對社會關系網(wǎng)絡圖進行分析。在dPCR網(wǎng)絡中，有10個主要主題詞/副主題詞的點度中心度大于平均值50.96，同時包含了排名前10的高頻主題詞/副主題詞中的8個，在這8個高頻主題詞中“LungNeo⁃ plasms/*genetics”的點度中心度最高，為167。中間中心度前兩名分別為23.58、21.19，分別代表“Molec⁃ularDiagnosticTechniques/*methods”和“DNAMuta⁃tionalAnalysis/*methods”，這兩個主題詞在網(wǎng)絡中具有較強的中介作用。“DNAMutationalAnalysis/*methods”具有最高的接近中心度85.71。為便于理解，我們根據(jù)中間中心度繪制了社會關系網(wǎng)絡圖。

　　3討論

　　文獻計量學研究中，主要主題詞可揭示所在文獻中核心的內容，大量主題詞集合可反映該學科的研究現(xiàn)狀和發(fā)展狀況，目前該研究方法已廣泛用于病原微生物分析及軍事訓練分析等多個領域[4，12]。為系統(tǒng)考察dPCR的基本知識結構，本研究在文獻計量學基礎上，將共詞分析，戰(zhàn)略坐標以及社會關系網(wǎng)絡分析結合起來。根據(jù)共詞分析，將緊密度強的主題詞形成類別并分析。

　　3.1類別1：肺癌突變基因快速檢測方面的應用肺癌是世界上新發(fā)病例和死亡人數(shù)最多的癌癥，非小細胞肺癌是最常見的亞型，約占所有病例的85%[13]。表皮生長因子受體(epithelialgrowthfactorreceptor，EGFR)、鼠類肉瘤病毒癌基因(kirstenratsarcomaviraloncogene，KRAS)等癌基因的某些突變與非小細胞肺癌治療藥物敏感性相關，肺癌突變基因的全面分析對非小細胞肺癌患者提供最佳治療方案至關重要[14，15]。

　　目前，dPCR技術已證明在鑒定和定量腫瘤游離DNA突變方面具有極高的靈敏度和準確性，特別是在藥物敏感或耐藥的腫瘤突 變基因評估中具有很高參考價值，為臨床診斷、治療方案優(yōu)化及預后評估提供了重要的檢測依據(jù)[16]。

　　3.2類別2：原癌基因突變檢測方法的建立與臨床應用癌癥檢測，即對原癌基因和關鍵信號通路中的體細胞變異進行篩選，對完善臨床診斷、藥物靶向治療提供幫助[17]。EGFR及其下游信號通路參與了包括結直腸癌在內的多種人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[18]。

　　目前應用抗EGFR單抗[如帕尼曲單抗(pani⁃tumab)或西妥昔單抗(cetuximab)]可使患者取得一定的療效，但這種療效與患者EGFR基因突變與否密切相關[19]。因此，在治療前對患者進行針對性的基因檢測，對其后續(xù)療效檢測及評估具有重要意義。類別1和類別2具有緊密相關性，位于戰(zhàn)略坐標圖中第一象限，表明目前該方面研究在整體研究中處于核心且成熟的地位，是整個研究的熱點領域。

　　3.3類別3：液體活檢概念的提出及應用癌癥基因變化分析是目前癌癥患者管理和治療決策的核心問題。然而，目前用于癌癥基因檢測的原料，如腫瘤部位穿刺活檢、手術切除腫瘤或者石蠟保存腫瘤樣本給檢測分析帶來一定的局限性[20]。液體活檢提供了檢測、分析和監(jiān)測各種體液(如血液或尿液)中癌癥成分的機會，而不是在腫瘤組織的碎片中[21]。液體活檢除可實現(xiàn)一種非侵入性或微創(chuàng)的樣本獲取方式外，更使得對腫瘤的連續(xù)監(jiān)測成為可能。近幾年，在dPCR技術和下一代測序技術大力發(fā)展背景下，液體活檢為臨床檢測作出的貢獻越來越大。

　　3.4類別4：無創(chuàng)產(chǎn)前檢查及分子診斷等方面的應用傳統(tǒng)產(chǎn)前檢查方式，如絨毛取樣和羊膜穿刺都是侵入性的，存在流產(chǎn)風險[22]。1997年，在母體循環(huán)血中鑒定出無細胞胎兒DNA(CffDNA)，使得通過簡單的靜脈穿刺進行非侵入性的產(chǎn)前診斷成為可能[23]。然而，CffDNA通常只占孕婦血漿總DNA的10%~20%，存在大量母體DNA背景的干擾，使這種無創(chuàng)檢測方法的發(fā)展受到很大限制[24]。dPCR技術在精準檢測方面具有獨特優(yōu)勢。因其可在復雜背景信息中精確檢測到胎兒DNA，dPCR目前已在21三體綜合征、常染色體遺傳病以及性連鎖遺傳病檢測研究方面取得一定進展，為以后臨床廣泛應用打下了基礎[25]。類別3和類別4也有密切關聯(lián)，處于戰(zhàn)略坐標圖中的第3象限，表明該方面的研究處于整體研究的相對邊緣區(qū)域，具有較大的發(fā)展空間。

　　3.5類別5：婦科腫瘤檢查及監(jiān)測中的應用美國癌癥協(xié)會報道，大多數(shù)婦科腫瘤患者通過手術和術后化療方式可得到治療，但在目前監(jiān)測技術下，有超過半數(shù)患者在18個月內復發(fā)，并最終導致死亡。因此，及時有效的術后監(jiān)測成為提高存活率的關鍵。循環(huán)中的無細胞DNA被認為是從正常細胞和癌細胞中脫落或釋放，并將循環(huán)中的無細胞血漿腫瘤DNA稱為血漿腫瘤DNA(ptDNA)[26]。

　　最近有研究使用dPCR檢測轉移性乳腺癌患者的前瞻性研究，將ptDNA與循環(huán)腫瘤細胞和乳腺癌血清標志物CA15⁃3進行了比較，并表明ptDNA更準確地反映了腫瘤負荷，動態(tài)監(jiān)測范圍更大，便于后續(xù)治療和疾病進展監(jiān)控[27]。

　　社會關系網(wǎng)絡中顯示，前10名高頻主題詞中，有8個具有較高的點度中心度。根據(jù)點度中心度的定義，我們認為高頻主題詞，如“LungNeoplasms/*genetics”，與其他成分具有最強的直接聯(lián)系，是整個研究領域的核心問題。就本研究選用的中間中心度而言，“MolecularDiagnosticTechniques/*meth⁃ods”和“DNAMutationalAnalysis/*methods”處于整個網(wǎng)絡的中樞位置，表明它們在控制其他成分的相互連接方面具有最大作用。“PrenatalDiagnosis/*methods”“ViralLoad/*methods”和“DNACopyNum⁃berVariations/*genetics”處于該網(wǎng)絡的邊緣，表明dPCR技術在產(chǎn)前檢查及病毒載量中的運用是新興領域，具有巨大研究潛力。

　　本文所采用的雙聚類分析和戰(zhàn)略坐標圖可分別用于展示特定的主題詞結構和評估每個類別的成熟狀態(tài)，但這兩種方法都不能解釋各個節(jié)點之間的相互聯(lián)系。社會關系網(wǎng)絡圖彌補了上述不足，描述了整個領域中節(jié)點之間的關系。本研究在對dPCR主要主題詞進行共詞分析的基礎上，將戰(zhàn)略坐標與社會關系網(wǎng)絡圖結合，描述了整個領域的中心研究以及新興領域，為研究者發(fā)展和使用這一新技術提供了幫助。

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　　作者：杜奕溥1，2，趙勇1，楊瑞馥1，宋亞軍1

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