西瓜果實(shí)形狀的分子精準(zhǔn)鑒定

　　摘要：為了實(shí)現(xiàn)西瓜果實(shí)形狀的分子精準(zhǔn)鑒定，利用“國(guó)家西瓜甜瓜中期庫”的資源和高通量測(cè)序平臺(tái)，利用兩個(gè)不同的雜交分離群體(F2和BC1P1)分別鑒定到一個(gè)159bp插入缺失和一個(gè)非同義SNP導(dǎo)致的果形突變(由圓果形變?yōu)殚L(zhǎng)果形)，且SNP突變?cè)?59bp插入缺失的基因組區(qū)域內(nèi)。利用這個(gè)SNP開發(fā)CAPS標(biāo)記Markersun在兩個(gè)群體和28份西瓜種質(zhì)中進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記Markersun在兩個(gè)群體中與果形表型共分離;在西瓜種質(zhì)中可同時(shí)區(qū)分插入缺失和SNP的變異，且與果形表型共分離。同時(shí)這兩個(gè)變異與果形的共分離在196份西瓜核心種質(zhì)的基因型分型中也得到驗(yàn)證。此外，通過對(duì)不同類型西瓜種質(zhì)的基因型分析發(fā)現(xiàn)，SNP變異導(dǎo)致的長(zhǎng)果形出現(xiàn)的時(shí)間更早且獨(dú)立遺傳，而159bp插入缺失引起的長(zhǎng)果形是栽培西瓜馴化過程中產(chǎn)生的。本研究首次利用不同類型的西瓜核心種質(zhì)實(shí)現(xiàn)了西瓜果形的分子精準(zhǔn)鑒定，還挖掘到兩個(gè)西瓜果形的功能變異并開發(fā)標(biāo)記，為西瓜果形的分子精準(zhǔn)鑒定提供技術(shù)支撐，同時(shí)為果形性狀基因功能驗(yàn)證提供靶標(biāo)，加速了西瓜果形性狀基因的調(diào)控機(jī)理研究。

　　關(guān)鍵詞：西瓜;果形;功能分子標(biāo)記;核心種質(zhì);精準(zhǔn)鑒定

　　果實(shí)形狀是瓜果類園藝作物的重要性狀，同時(shí)也是產(chǎn)品分類、定級(jí)與評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。前人研究發(fā)現(xiàn)番茄的果形主要由個(gè)基因SUN、OVATE、LOCULENUMBER(LC)和FASCIATED(FAS)調(diào)控(Rodriguezetal.，2011;Monforteetal.，2014)，黃瓜和甜瓜中與控制番茄果形的SUN同源的基因CsSUM和CmSUN14也是控制果形的關(guān)鍵基因(Panetal.，2017)。

　　西瓜種植論文范例：小蘭西瓜早春無公害設(shè)施栽培技術(shù)

　　西瓜果實(shí)形狀有圓形和非圓形(橢圓和長(zhǎng))，受顯性單基因控制(Weetman，1937;Poole&Grimball，1945)。受環(huán)境及栽培條件影響，橢和長(zhǎng)的界限模糊，難以區(qū)分，但圓與二者的區(qū)別很大，因此筆者在本文中將橢圓和長(zhǎng)統(tǒng)稱長(zhǎng)。前人利用不同遺傳背景的西瓜材料在號(hào)染色體的相同區(qū)域穩(wěn)定檢測(cè)到一個(gè)果形主效QTL(Sandlinetal.，2012;Liuetal.，2016;Douetal.，2018;Guoetal.，2019;Legendreetal.，2020)，并在QTL區(qū)域發(fā)現(xiàn)SUN的同源基因Cla011257。同時(shí)開發(fā)了一些分子標(biāo)記，包括個(gè)InDel(Douetal.，2018)和個(gè)SNP(Legendreetal.，2020)。

　　因所用的材料有限，有關(guān)西瓜果形的關(guān)鍵遺傳變異和遺傳進(jìn)化至今尚不清楚。分子標(biāo)記輔助選擇是利用與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖或表現(xiàn)共分離的分子標(biāo)記進(jìn)行選擇的一種方法，但由于分子標(biāo)記與目的基因之間的連鎖不夠緊密使得遺傳交換在所難免，性狀預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率難以達(dá)到預(yù)期(Fuetal.，2017);并且育種中常用的分子標(biāo)記大多位于基因間非表達(dá)序列，無法區(qū)別與其連鎖基因的表達(dá)序列的差異。而功能分子標(biāo)記源于控制目標(biāo)性狀基因的功能變異(Kageetal.，2016)，對(duì)基因的選擇更為有效，并且功能標(biāo)記的應(yīng)用還可以更好地避免連鎖累贅，減少供體不利基因向受體導(dǎo)入。

　　功能分子標(biāo)記已在一些作物，如水稻(Jietal.，2010;Zhouetal.，2013)、小麥(Periyannanetal.，2014)、玉米(Azmachetal.，2013)、大豆(Liuetal.，2014)等得到應(yīng)用，但園藝作物的功能分子標(biāo)記甚少。為挖掘影響西瓜果形的功能變異并實(shí)現(xiàn)果形性狀的分子精準(zhǔn)鑒定，本研究結(jié)合深度重測(cè)序和簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，利用不同類型的西瓜骨干親本構(gòu)建和BC分離群體，分別定位西瓜果形性狀的QTL并挖掘關(guān)鍵的遺傳變異，開發(fā)標(biāo)記并在群體和核心種質(zhì)中進(jìn)行驗(yàn)證，為西瓜果形分子標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)支撐，同時(shí)加速西瓜果形性狀基因的調(diào)控機(jī)理研究。

　　1材料與方法

　　1.1試驗(yàn)材料與群體構(gòu)建

　　用于基因定位的第套群體是利用圓果形栽培西瓜品系‘ZXG01478’為母本，長(zhǎng)果形栽培西瓜品系‘14CB11’為父本，雜交獲得，進(jìn)一步自交獲得含有93個(gè)單株的群體(Shangetal.，2016);父母本、和群體的各個(gè)單株在2013年秋季種植，分別自交留種并于成熟期調(diào)查果實(shí)形狀等數(shù)據(jù)。第套群體是利用圓果形栽培西瓜品系‘B100’為母本，長(zhǎng)果形栽培西瓜品系‘B136’(已驗(yàn)證與長(zhǎng)果形西瓜品系‘14CB11’不同)為父本，雜交獲得，進(jìn)一步與母本‘B100’回交獲得含有93個(gè)單株的BC群體;父母本、和BC群體各單株在2017年春季種植，分別自交留種并于成熟期調(diào)查果實(shí)形狀等數(shù)據(jù)。另有調(diào)查鑒定果形的128份西瓜種質(zhì)(李娜等，2020)包括份缺須西瓜、份藥西瓜、30份野生西瓜、21份黏籽西瓜和69份普通西瓜。所有材料均按常規(guī)方法種植。

　　1.2性狀調(diào)查與數(shù)據(jù)分析

　　果實(shí)形狀、果實(shí)長(zhǎng)度、果實(shí)寬度、果形指數(shù)的性狀調(diào)查方法參照項(xiàng)目組的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(李娜等，2020)�？ǚ綔y(cè)驗(yàn)和相關(guān)性分析分別利用SASV8的Freq和corr程序進(jìn)行。

　　1.3QTL定位與連鎖分析

　　利用包含2634個(gè)SNP標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜(Shangetal.，2016)和表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位。QTL掃描采用WinQTLcartographer2.5軟件(http：//statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)的復(fù)合區(qū)間作圖法(compositeintervalmapping，CIM)。基于標(biāo)準(zhǔn)模型Model6，余因子的選擇采用前后回歸相結(jié)合(forwardbackwardstepwiseregression)的方法(Pin=0.05和Pout=0.05)。

　　背景標(biāo)記數(shù)、窗口大小、掃描間距和運(yùn)行速度分別設(shè)為、10cM、5cM和1cM。QTL顯著性的閾值用1000次的排布測(cè)驗(yàn)(Churchill&Doerge，1994)確定。采用=0.05的顯著性水平來確認(rèn)QTL。新開發(fā)的分子標(biāo)記和連鎖群上其他SNP標(biāo)記運(yùn)用JoinMap4.0軟件(http：//www.kyazma.nl/index.php/mc.JoinMap)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。軟件參數(shù)設(shè)置：擬合度閾值≤，最大重組率0.4，最小LOD為2.0，作圖函數(shù)選擇Kossambi函數(shù)。

　　1.4標(biāo)記開發(fā)

　　對(duì)個(gè)親本材料利用IlluminaHiSeqTM2500進(jìn)行約20×深度的重測(cè)序，參考基因組為全基因組測(cè)序的西瓜品種‘97103’(Guoetal.，2013)。SNP和InDel的檢測(cè)主要使用GATK軟件工具包(McKennaetal.，2010)實(shí)現(xiàn)。利用自編的Perl程序提取插入缺失相應(yīng)位置前后500bp的序列。利用Primer5.0軟件(Clarke&Gorley，2001)設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)InDel的引物對(duì)。利用在線分析軟件dCAPSFinder2.0(http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)(Neffetal.，2002)和Oligo7軟件設(shè)計(jì)CAPS引物(SNP轉(zhuǎn)化)并選擇常用價(jià)廉的限制性內(nèi)切酶。

　　1.5基因型鑒定與數(shù)據(jù)分析

　　西瓜葉片的DNA提取采用改良的CTAB方法，PCR的擴(kuò)增按照常規(guī)方法進(jìn)行，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳、顯影、染色和帶型判讀。PCR產(chǎn)物直接利用其引物由北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。重測(cè)序數(shù)據(jù)的直觀查看利用IGV(IntegrativeGenomicsViewer)軟件包。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1西瓜果實(shí)形狀基因定位

　　群體的母本‘ZXG01478’為圓果形，果實(shí)長(zhǎng)度、果實(shí)寬度、果形指數(shù)分別為(17.25±0.35)cm、(16.50±1.13)cm、1.05±0.05。父本‘14CB11’為長(zhǎng)果形，果實(shí)長(zhǎng)度、果實(shí)寬度、果形指數(shù)分別為(26.00±1.50)cm、(16.17±1.04)cm、1.61±0.07。趨向于長(zhǎng)果形，果實(shí)長(zhǎng)度、果實(shí)寬度、果形指數(shù)分別為(25.55±1.48)cm,(17.00±1.84)cm、1.51±0.08，更接近于父本。群體93個(gè)單株的果實(shí)長(zhǎng)度、果實(shí)寬度和果實(shí)指數(shù)的頻率分布圖呈現(xiàn)正態(tài)或近似正態(tài)分布。群體中長(zhǎng)果形的70個(gè)，圓果形的23個(gè)，基本符合3:1的分離比(χ=1.04，=0.31)，表明果形受個(gè)顯性基因控制。相關(guān)性分析表明，果實(shí)長(zhǎng)度與果形指數(shù)顯著正相關(guān)(r=0.91，<0.0001)，果實(shí)寬度與果形指數(shù)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r=–0.45，<0.0001)，而果實(shí)長(zhǎng)度和果實(shí)寬度無顯著的相關(guān)性(r=–0.07，=0.534)。

　　2.3西瓜種質(zhì)果實(shí)形狀的精準(zhǔn)鑒定

　　利用Markersun的引物在128份西瓜種質(zhì)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用限制性內(nèi)切酶TagI進(jìn)行酶切�？梢悦鞔_顯示159bpInDel和SNP的變異。主帶有種帶型，259bp(，果形為長(zhǎng))，151bp和108bp兩條帶(，果形為圓)，100bp(，果形為長(zhǎng))，且存在AB、BC的雜合帶，表型皆為長(zhǎng)果形，與果形的顯性基因結(jié)果一致。標(biāo)記Markersun在種質(zhì)中的基因型鑒定結(jié)果與表型性狀(表)完全吻合。

　　利用項(xiàng)目組進(jìn)行的196份西瓜核心種質(zhì)(本試驗(yàn)所用128份包含在內(nèi))重測(cè)序獲得的SNP變異發(fā)現(xiàn)，有159bp缺失的長(zhǎng)果形種質(zhì)在號(hào)染色體的26847041bp位置為缺失(未知序列)，而其他的種質(zhì)基因型分為兩類，即參考基因組基因型和突變SNP基因型，且與果實(shí)形狀表型完全共分離，這與利用標(biāo)記Markersun分析的結(jié)果完全一致。

　　查考候選基因Cla011257及其上、下游5kb的基因組區(qū)域的SNP和小的InDel，除了這個(gè)SNP(Chr6：26847041)，其他的變異與果實(shí)形狀皆無顯著的相關(guān)性。因此，推測(cè)這個(gè)SNP和159bpInDel都可導(dǎo)致候選基因Cla011257功能發(fā)生改變從而使西瓜果形由圓變?yōu)殚L(zhǎng)。

　　野生西瓜中的長(zhǎng)果形西瓜全部是SNP變異引起;而普通西瓜中的長(zhǎng)果形部分是SNP變異引起，部分是159bpInDel引起，說明SNP變異導(dǎo)致的長(zhǎng)果形出現(xiàn)的時(shí)間更早并獨(dú)立遺傳，而159bpInDel引起的長(zhǎng)果形西瓜是栽培西瓜馴化過程中產(chǎn)生的。

　　3討論

　　Cla011257屬于SUN基因家族成員，是西瓜果形的候選基因(Douetal.，2018;Legendreetal.，2020)。已有研究表明，SUN在其他園藝作物中控制果實(shí)長(zhǎng)度和果形，如番茄、甜瓜和黃瓜(Xiaoetal.，2008;Monforteetal.，2014;Perpinaetal.，2016;Panetal.，2017)等。

　　Dou等(2018)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)果形的西瓜候選基因Cla011257存在個(gè)159bp的缺失，導(dǎo)致53個(gè)氨基酸的缺失，可能導(dǎo)致其功能發(fā)生改變，開發(fā)的InDel標(biāo)記在分離群體中得到驗(yàn)證。Legendre等(2020)利用份不同果形的西瓜材料，對(duì)候選基因Cla011257進(jìn)行測(cè)序和變異分析，發(fā)現(xiàn)個(gè)159bpInDel和個(gè)SNP，并開發(fā)KASP標(biāo)記在分離群體中進(jìn)行驗(yàn)證。上述研究?jī)H在幾份不同果形材料及其后代分離群體中進(jìn)行驗(yàn)證，有限的資源數(shù)使得對(duì)西瓜果形的進(jìn)化和馴化難以窺見全貌。

　　本研究中，首先針對(duì)性的構(gòu)建果形相關(guān)群體，挖掘與果形性狀相關(guān)的候選基因和關(guān)鍵遺傳變異。值得關(guān)注的是，在果形基因Cla011257的第個(gè)外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)個(gè)159bpInDel和一個(gè)非同義SNP在兩個(gè)群體中分別與表型共分離。利用128份西瓜種質(zhì)對(duì)開發(fā)的功能分子標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，標(biāo)記基因型和果形表型完全共分離。全部196份西瓜核心種質(zhì)的重測(cè)序結(jié)果也證實(shí)這個(gè)SNP和InDel共同解釋核心種質(zhì)100%的表型變異。

　　在資源繁殖更新和數(shù)據(jù)調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，搜集到的有限幾份野生近緣種諾丹西瓜、缺須西瓜、熱迷西瓜、藥西瓜都是圓果形，半野生種質(zhì)黏籽西瓜全部是圓果形，而野生西瓜和現(xiàn)代栽培種質(zhì)既有圓果形，又有長(zhǎng)果形。通過分析發(fā)現(xiàn)，野生西瓜種質(zhì)中的長(zhǎng)果形全部是SNP突變導(dǎo)致，而現(xiàn)代栽培西瓜中的長(zhǎng)果形部分是SNP突變導(dǎo)致，部分是159bp的缺失導(dǎo)致。因此推測(cè)，這個(gè)SNP在早期進(jìn)化時(shí)期出現(xiàn)并在馴化的過程中獨(dú)立遺傳，而159bpInDel在栽培西瓜的馴化過程中出現(xiàn)。

　　至此，推測(cè)位于候選基因Cla011257第個(gè)外顯子上的這個(gè)非同義點(diǎn)SNP突變和159bpInDel皆可導(dǎo)致基因功能發(fā)生改變從而使得果形由圓形變?yōu)殚L(zhǎng)形。本研究通過西瓜分離群體和核心種質(zhì)的分析，獲得兩個(gè)獨(dú)立遺傳的功能變異(個(gè)SNP和個(gè)InDel)與果形性狀共分離，基本實(shí)現(xiàn)了西瓜果形的分子精準(zhǔn)鑒定，為西瓜果形的定向育種提供技術(shù)支撐和理論指導(dǎo)，并為后續(xù)關(guān)鍵變異和功能基因的驗(yàn)證提供靶標(biāo)，加速了果形性狀基因的調(diào)控機(jī)理研究。

　　作者：李娜，尚建立，李楠楠，周丹，孔勝楠，王吉明，馬雙武

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