本文摘要：摘要：綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)是目前研究較多的生防菌種之一。十九世紀(jì)初，Miguela首次分離，將其鑒定為假單胞菌(Pseudomonas)，并將機會性病原菌綠膿桿菌作為其模式菌株，而后Peix于007年，重新將其分類為綠針假單胞菌亞種(P.chlororaphi)。
摘要：綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)是目前研究較多的生防菌種之一。十九世紀(jì)初，Miguela首次分離，將其鑒定為假單胞菌(Pseudomonas)，并將機會性病原菌綠膿桿菌作為其模式菌株，而后Peix于007年，重新將其分類為綠針假單胞菌亞種(P.chlororaphi)。目前該菌種已報道有個亞種，均可產(chǎn)生有顏色的吩嗪類化合物抗生素。該種的菌株多分離自植物根際，對植物抵抗病原菌、線蟲等的侵染起到保護作用。本文結(jié)合我們分離獲得的一株綠針假單胞菌的功能研究、基因組分析及相關(guān)文獻(xiàn)資料，系統(tǒng)描述了綠針假單胞菌的分類學(xué)特征、基因組特點、代謝產(chǎn)物功能及其應(yīng)用開發(fā)前景等，以期為綠針假單胞菌在活性代謝產(chǎn)物發(fā)掘、基因功能研究及其農(nóng)業(yè)應(yīng)用等方面提供借鑒。
關(guān)鍵詞：綠針假單胞菌，生防，次生代謝產(chǎn)物，農(nóng)業(yè)應(yīng)用
土壤環(huán)境一直被視為微生物資源開發(fā)的天然寶庫，土壤中存在很多具有促進(jìn)植物生長、抑制植物病原菌活性的微生物[1]。這些具有生防功能的根際促生菌，在維持植物正常生長、抵抗病原生物等方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。假單胞菌(Pseudomonas)作為普通生境優(yōu)勢細(xì)菌屬之一，廣泛活躍于植物周圍(包括植物根際與葉面)，其屬內(nèi)很多菌株為植物根際促生菌(PlantGrowth-PromotingRhizobacteria，PGPR)，這些菌株定植于植物根際，幫助植物抵御病害并促進(jìn)植物的生長[2-3]。
農(nóng)業(yè)土壤論文范例：土壤環(huán)境質(zhì)量新標(biāo)準(zhǔn)評價應(yīng)用誤區(qū)探討
作為生防領(lǐng)域最具應(yīng)用潛力的菌株，假單胞菌屬主要從以下三個方面發(fā)揮其生防功能：(1)合成抗生素抑制病原生物。生防假單胞菌可分泌多種類型的抗生素，其代表為吩嗪類抗生素，如吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylicacid，PCA)、綠膿菌素(Pyocyanin，PYO)等[3];(2)部分假單胞菌具有合成和分泌鐵載體能力，可將土壤中的Fe3+轉(zhuǎn)化成為可被細(xì)胞吸收的Fe2+的形式，以促進(jìn)植物生長。另外，菌株可以通過對鐵元素競爭，從而抑制病原菌生長[2,4]。(3)存在誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性(inducedsystemicresistance，ISR)。如熒光假單胞菌WCS358存在多個誘導(dǎo)因子，均能使擬南芥產(chǎn)生ISR[2,5-6]。
綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)是公認(rèn)的環(huán)境友好型植物促生菌，該菌株分布范圍廣，對生態(tài)環(huán)境具有較強適應(yīng)能力。大多數(shù)綠針假單胞菌是從植物根際分離獲得，菌株的代謝產(chǎn)物對植物具有一定的保護作用，具有生防的潛力與應(yīng)用前景，因此該菌株獲得生防領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[7-8]。本文擬在綠針假單胞菌分類學(xué)特征、活性代謝產(chǎn)物、菌株生防功能的基礎(chǔ)上，發(fā)掘其農(nóng)業(yè)上的開發(fā)應(yīng)用前景，結(jié)合目前實驗室的科學(xué)方法和技術(shù)，為進(jìn)一步揭示其基因功能和調(diào)控機理提供可能與借鑒。
1綠針假單胞菌的分類地位與基本特征
十九世紀(jì)初，MIguela首次分離獲得綠針假單胞菌，并將其鑒定為假單胞菌[8]。綠針假單胞菌的分類鑒定較為復(fù)雜。起初，菌株P(guān)seudomonaschlororaphis，Pseudomonasaureofaciens和Pseudomonasaurantiaca均被認(rèn)為是假單胞菌屬中的獨立的種。
直到1989年，Johnson和Palleroni基于DNA同源性及其表型等特點，提議將P.aureofaciens作為P.chlororaphis同種異型菌株[9]。2005年，在第二版的伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊Palleroni將P.aureofaciens和P.chlororaphis合并為P.chlororaphis，但此時P.aurantiaca仍然被許多研究者作為獨立的種在使用[9-11]。2007年，Peix基于菌株的表型特征及分子生物學(xué)的相關(guān)數(shù)據(jù)，將綠針假單胞菌的相關(guān)菌株重新分類，將其命名為P.chlororaphis，并包含三個亞種，分別為P.chlororaphissubsp.aurantiaca，P.chlororaphissubsp.chlororaphis和P.chlororaphissubsp.aureofaciens[10]。010年，綠針假單胞菌增加一個新的分枝—綠針假單胞菌雙魚亞種(.chlororaphissubsp.piscium)[12-13]，該菌株分離自魚的腸道內(nèi)。之前研究較多的、分離自番茄根際的菌株CL1391，也屬于該亞種[8]。
本實驗室之前在番茄根際土壤中分離獲得菌株P(guān)S41，經(jīng)16SrRNA測序比對，鑒定為綠針假單胞菌致金色亞種P.chlororaphissubsp.aureofaciensPS41[14]，該菌株可產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)抑制黑斑病病菌的生長，并對秀麗隱桿線蟲具有高效毒殺活性[14-15]。綠針假單胞菌是革蘭氏陰性菌，好氧，可運動，菌體呈綠色、黃色或橙色的γ變形菌綱[8]。典型的綠針假單胞菌株具有定植于植物的能力，并具有抑制植物病原菌的活性[1]。
Peix等人也討論了綠針假單胞菌亞種之間的一些可變表型，比如潛在的反硝化的能力，以阿拉伯糖或葡萄糖酸鹽作為碳源的潛能[10,13]。綠針假單胞菌在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上生長時，不同亞種之間存在一些可視的識別特征即色素，這些色素的產(chǎn)生與綠針假單胞菌產(chǎn)生的抗真菌類物質(zhì)吩嗪(henazines)有關(guān)。菌株P(guān)S41產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物主要介導(dǎo)了對病原生物的拮抗作用，這些次級代謝產(chǎn)物是受雙組分調(diào)控體系GacGacA調(diào)節(jié)[1]。
2綠針假單胞菌的活性代謝產(chǎn)物研究
2.1綠針假單胞菌產(chǎn)生的抗生素
綠針假單胞菌可以合成多種拮抗病原菌的抗生素(吩嗪衍生物，HCN，鐵載體等)，而這些代謝產(chǎn)物的特性決定了綠針假單胞菌的生防潛質(zhì)及應(yīng)用前景。綠針假單胞菌可產(chǎn)生特征性色素，其中P.chlororaphissubsp.chlororaphis呈現(xiàn)出綠色，P.chlororaphissubsp.aureofaciens產(chǎn)生金黃色色素，P.chlororaphissubsp.aurantiaca呈現(xiàn)出橙色，P.chlororaphissubsp.piscium可產(chǎn)生綠色與橙色兩種色素。
在產(chǎn)生抗生素的種類方面，不同的亞種之間也有明顯的區(qū)別，P.chlororaphissubsp.aurantiaca和P.chlororaphissubspaureofaciens產(chǎn)生的抗生素種類類似，主要有吩嗪羧酸，羥基吩嗪羧酸(hydroxyphenazinecarboxylicacid，OHPCA)，硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin，Prn)，hexyl,5propylresorcinol[16];P.chlororaphissubspchlororaphis產(chǎn)生的抗生素主要有吩嗪甲酰胺(Phenazine1carboxamide，PCN)，吩嗪羧酸，羥基吩嗪羧酸，硝吡咯菌素，hexyl,5propylresorcinol[17];P.chlororaphissubsppiscium產(chǎn)生的抗生素種類相對較少，主要為吩嗪甲酰胺和吩嗪羧酸。
2.2吩嗪類化合物的特點和功能
自然界中，天然的吩嗪化合物為色彩豐富的含氮次生代謝產(chǎn)物，合成于細(xì)胞生長的穩(wěn)定期，這類化合物對植物細(xì)胞的生長發(fā)育無顯著影響，但本身具有廣譜抗菌性，可用于防治植物真菌性病害[18-19]。有研究表明，產(chǎn)吩嗪類化合物的微生物對環(huán)境具有更好的適應(yīng)性。綠針假單胞菌在富營養(yǎng)的培養(yǎng)基上生長時，可產(chǎn)生色素，這也是分離鑒定該菌種的一個標(biāo)志性特征，而這種色素的產(chǎn)生主要歸因于該種菌株產(chǎn)生三環(huán)含氮物質(zhì)—吩嗪，吩嗪具有抗菌的功能，能影響細(xì)胞的信號[20]。
假單胞菌是最早被發(fā)現(xiàn)的吩嗪類物質(zhì)產(chǎn)生菌，在很長一段時間內(nèi)，假單胞菌被認(rèn)為是唯一產(chǎn)生天然吩嗪類化合物的菌屬，其中熒光假單胞菌通常只合成一種吩嗪類化合物(吩嗪羧酸)，而其他的假單胞菌則可以產(chǎn)生兩種或以上的吩嗪類物質(zhì)[3,21-22]。綠針假單胞菌株CL1319、P72和T66等，均可高效合成吩嗪類化合物。吩嗪類化合物在菌株與植物互作過程中發(fā)揮了重要的作用[20]。例如菌株CL1319產(chǎn)生的吩嗪對尖孢鐮刀菌具有較高的抗真菌活性[23]。吩嗪類化合物作為高效的抗菌劑，對環(huán)境友好，具有良好的農(nóng)業(yè)應(yīng)用與開發(fā)前景。
假單胞菌合成的吩嗪化合物主要具有種功能：抑制植物病原微生物和線蟲的侵染，保護植物[3];菌株在產(chǎn)生吩嗪類化合物和形成生物膜過程中，可促使植物的根際分泌可被菌體利用的營養(yǎng)物質(zhì)，二者互利共生[3];、可誘導(dǎo)番茄和大豆等植物的系統(tǒng)抗性。此外，吩嗪類化合物還能夠改變環(huán)境的理化性質(zhì)[3,24]。
2.3硝吡咯菌素和間苯二酚的抗菌作用
除吩嗪之外，綠針假單胞菌還可以產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物幫助植物抵抗微生物病原菌，如：硝吡咯菌素和間苯二酚[7]，這些物質(zhì)在植物本身的抗病體系中發(fā)揮了重要的作用。硝吡咯菌素是含有吡咯環(huán)的化合物，對多種真菌具有抑制作用，這一類抗生素在人類醫(yī)藥和農(nóng)用殺菌劑領(lǐng)域都有商業(yè)化應(yīng)用[25]。菌株CL1606雖然也能產(chǎn)生吩嗪，但是其產(chǎn)生的hexylpropylresorcinol是防治鱷梨白腐病的關(guān)鍵物質(zhì)。而綠針假單胞菌PA23產(chǎn)生吡咯硝酸鹽是其控制油菜白腐病的主要抗菌物質(zhì)，而非吩嗪。菌株05產(chǎn)生的吡咯硝酸鹽是抑制赤霉病菌的主要代謝產(chǎn)物[26]。因此，硝吡咯菌素和間苯二酚在綠針假單胞菌協(xié)助植物抵抗病原菌的過程中也發(fā)揮了重要的作用。
2.4氰化氫的殺蟲功能
綠針假單胞菌能夠產(chǎn)生氰化氫(CN)—由甘氨酸組成的一種簡單的水溶性揮發(fā)物質(zhì)。綠針假單胞菌A23的殺線蟲活性與其產(chǎn)生的硝吡咯菌素和氰化氫均有著密切的關(guān)系[27]。另外，F(xiàn)lury等人對綠針假單胞菌CL1391的研究顯示，氰化氫是該菌株毒殺線蟲幼蟲的關(guān)鍵組分，而非吩嗪或吡咯菌素[28]，綠針假單胞菌株產(chǎn)生的氰化氫可導(dǎo)致線蟲[29]和蚜蟲細(xì)胞死亡[30]。
2.5揮發(fā)性有機物(Volatileorganiccompounds,VOCs)的生防功能
目前，微生物產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物的功能研究吸引了很多學(xué)者的關(guān)注，研究表明揮發(fā)性有機物可以通過長距離擴散從而保護植物。由于微生物代謝的多功能性，一些自然界中原本不存在的揮發(fā)性物質(zhì)，很可能會在微生物生長的過程中被釋放出來，從而具有一些特殊的功能。
已有報道綠針假單胞菌可產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)幫助植物抵抗病原菌，例如，致金色綠針假單胞菌PS41可以產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)甲基丁醇、甲基丁醇和苯乙醇，對甘薯黑斑病菌有抑制作用，該菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)辛酸乙酯對秀麗隱桿線蟲C.elegans具有高效毒殺作用[14-15]。綠針假單胞菌和KNU17P可以產(chǎn)生碳?xì)浠衔锖褪煌?在菌株和71的代謝產(chǎn)物中，也檢測到了含硫的化合物組分，例如硫化氫、二甲基硫醚和甲硫醇等[31]。這些代物一方面可能直接抑制植物病原菌，另一方面可能與誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)有關(guān)。在微生物定殖于植物或其他寄主的條件下，產(chǎn)生的多種揮發(fā)性有機物，可以建立一種信號或一種雞尾酒式的OC混合物的作用模式，對于進(jìn)一步研究綠針假單胞菌的生防機制具有深層次的意義。
3綠針假單胞菌基因組與功能基因簇研究
綠針假單胞菌作為根際共生細(xì)菌，其能影響植物生長，并在控制植物病害和提高作物產(chǎn)量等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，因而對于該菌株的研究也逐步深入。綠針假單胞菌的主要研究方向包括菌株產(chǎn)活性物質(zhì)的分離篩選、代謝途徑的研究、菌株生物膜的形成、群體感應(yīng)體系、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而這一系列的研究都與菌株的基因組學(xué)關(guān)系緊密，基因組學(xué)的研究也成為構(gòu)建該菌株基因資源庫的理論支撐。近年來，綠針假單胞菌基因組數(shù)據(jù)不斷完善，為該菌株的基因組改造的實施奠定了基礎(chǔ)[16]。
4綠針假單胞菌的應(yīng)用研究現(xiàn)狀
綠針假單胞菌可以合成多種抗生素，具有抵抗病原生物的作用，綠針假單胞菌還具有較強的植物根際促生能力，使其在農(nóng)業(yè)和園藝領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用[47]。綠針假單胞菌對多種植物有防病促生作用[48]，能增強植物的抗逆性[49-50]、對環(huán)境友好、對生物無致病性[51]。
例如，防治番茄枯萎病[52]、煙草疫霉病[53]、辣椒疫霉病[54]、柏樹潰瘍病[48]和豆類炭疽病[55]等，同時對幾種農(nóng)業(yè)重要病原細(xì)菌有明顯的抑制作用，如莢殼伯克霍爾德菌(Burkholderiaglumae)、解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)、密執(zhí)安棒桿菌(Clavibactermichiganesis)、胡蘿卜果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovora)、丁香假單胞菌(Pseudomonas.yringae)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)等[56]。
綠針假單胞菌中的很多菌株已被廣泛且深入研究。菌株3084可合成吩嗪羧酸、羥基吩嗪羧酸和羥基吩嗪等抗生素，可以有效抑制小麥全蝕病[57]。而菌株P(guān)CL1391合成吩嗪羧酸和吩嗪甲酰胺，可有效抑制番茄病原菌尖孢鐮刀菌和可可棕櫚病原菌群結(jié)腐霉[58]。
菌株O6能合成藤黃綠菌素、吩嗪羧酸、羥基吩嗪羧酸和羥基吩嗪等物質(zhì)抑制病原菌，同時可以誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性，維持煙草葉和黃瓜葉的健康生長[59]。菌株P(guān)72可以合成吩嗪羧酸、羥基吩嗪羧酸和羥基吩嗪三種吩嗪化合物。菌株A23產(chǎn)生的硝吡咯菌素和氰化氫具有殺線蟲活性[27]。
菌株SPS41產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物辛酸乙酯和乙酸乙酯等具有高效的殺線蟲活性[14]。綠針假單胞菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有多樣性，而其作為根際細(xì)菌具有防治病原菌、殺蟲等功效，其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)在果蔬采后的保存過程中，也具有重要作用[15]，菌株P(guān)S41產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體甲基丁醇、甲基丁醇和苯乙醇對甘薯黑斑病病菌有顯著的拮抗作用，克服了化學(xué)農(nóng)藥在防治甘薯采后黑斑病中存在的污染環(huán)境、毒素殘留、威脅人類健康、催生抗藥菌等問題，在果蔬的采后保存中具有潛在的應(yīng)用價值[15,60]。
5結(jié)語和展望
綠針假單胞菌作為生防細(xì)菌資源應(yīng)用在農(nóng)業(yè)及食品業(yè)具有顯著的優(yōu)勢。一方面，綠針假單胞菌來源方便，廣泛分布于普通土壤環(huán)境及植物根際;另一方面，這類菌株是環(huán)境友好型微生物，菌株無毒性無污染，不會對人體造成傷害，也不會污染環(huán)境，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)及食品業(yè)具有安全性。美國環(huán)保局認(rèn)證了綠針假單胞菌為非人體、野生動物及環(huán)境病原菌，部分相關(guān)的商業(yè)產(chǎn)品已經(jīng)應(yīng)用[1]。除此之外，綠針假單胞菌可分泌抗生素和鐵載體，并且在特定的環(huán)境下可以誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性以及促進(jìn)植物生長，這些優(yōu)勢都為綠針假單胞菌的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
目前，國際上研究報道較多的是利用綠針假單胞菌防治真菌和卵菌病害。綠針假單胞菌在生防制劑的商業(yè)應(yīng)用主要包括代謝產(chǎn)物的應(yīng)用和菌株細(xì)胞的應(yīng)用。在代謝產(chǎn)物應(yīng)用方面，綠針假單胞菌基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組及代謝組學(xué)的研究成果，為該菌的基因修飾從而高效產(chǎn)生特定代謝產(chǎn)物提供了理論依據(jù)。綠針假單胞菌的基因組學(xué)分析顯示，四個亞種共挖掘到類、43個基因簇，而個亞種共同的基因簇只有個，說明綠針假單胞菌中還有大量未開發(fā)的次級代謝產(chǎn)物。
綠針假單胞菌可產(chǎn)生多種高效抗生素抑制病原生物，產(chǎn)生吲哚乙酸促進(jìn)植物生長，產(chǎn)生應(yīng)用于食品工業(yè)的羥基苯甲酸及其衍生物，這些都是可以進(jìn)一步發(fā)掘的資源。針對不同的需求，可通過對菌株的代謝途徑進(jìn)行合理設(shè)計和遺傳學(xué)修飾，改造細(xì)胞特性從而應(yīng)用于實際生產(chǎn)中。
該菌在代謝產(chǎn)物方面的應(yīng)用潛力，可以從以下幾個方向深入發(fā)掘：(1)通過分離代謝產(chǎn)物，發(fā)掘其產(chǎn)生的功能型抗生素;(2)高通量篩選抗生素高產(chǎn)菌株，為菌株的生防和工業(yè)應(yīng)用提供資源;(3)以最小基因組方法，設(shè)計工程菌株，從而在節(jié)省資源的基礎(chǔ)上并高效獲得代謝產(chǎn)物;(4)克隆表達(dá)抗生素合成的基因簇，構(gòu)建工業(yè)生產(chǎn)菌株，高效表達(dá)抗生素。
菌株細(xì)胞主要可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，作為生防制劑使用，以達(dá)到對植物的抗病促生作用，同時克服了化學(xué)農(nóng)藥的弊端，從而成為真正的綠色農(nóng)藥。在生物防治領(lǐng)域，綠針假單胞菌代謝產(chǎn)物具有多樣性，可高效合成吩嗪，氫化氰及揮發(fā)性有機化合物，對病原微生物、昆蟲和線蟲具有拮抗作用;菌株本身可形成生物膜，有利于其在植物根際的定殖，發(fā)揮促生防病功能。總之，綠針假單胞菌具有的促進(jìn)植物生長、生物防治病蟲害，以及產(chǎn)生豐富活性次生代謝產(chǎn)物的能力，使其在農(nóng)業(yè)應(yīng)用上具有較好的開發(fā)前景。
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作者：張春媚，徐明潔，李雪威，邢珂，秦盛
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