合成生物學(xué)在農(nóng)殘檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

　　摘要：近年來(lái)，合成生物學(xué)在多個(gè)領(lǐng)域嶄露頭角，在農(nóng)殘檢測(cè)中也發(fā)揮越來(lái)越重要的作用�；�于合成生物學(xué)模塊化和工程化指導(dǎo)思想，各種基因部件的多樣化組合為農(nóng)殘檢測(cè)提供更多方案。簡(jiǎn)便、耐用、低成本、原位檢測(cè)等特點(diǎn)也使其較傳統(tǒng)檢測(cè)手段具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。但與此同時(shí)，合成生物學(xué)在農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用也受到復(fù)雜檢測(cè)環(huán)境和生物安全性等問(wèn)題的影響。結(jié)合目前合成生物學(xué)在有機(jī)氯、有機(jī)磷、擬除蟲菊酯和氨基酸甲酯類農(nóng)藥檢測(cè)中的應(yīng)用與創(chuàng)新實(shí)例，歸納合成生物學(xué)在農(nóng)殘檢測(cè)中應(yīng)用的原理，分析并探討合成生物學(xué)技術(shù)未來(lái)在農(nóng)殘檢測(cè)中的發(fā)展?jié)摿εc應(yīng)用前景。

　　關(guān)鍵詞：合成生物學(xué);農(nóng)殘檢測(cè);生物反應(yīng)器;酶;生物技術(shù)

　　二十世紀(jì)中葉以來(lái)，隨著化學(xué)品生產(chǎn)工藝的革新，廉價(jià)高效的農(nóng)藥逐漸成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的“必需品”。世界每公頃耕地面積的農(nóng)藥使用量(kg/ha)從1990年至2017年增長(zhǎng)了70%[1]。在全球范圍內(nèi)，每年農(nóng)藥的使用量接近30億公斤，商品估值約為400億美元[2]，這些數(shù)據(jù)表明農(nóng)藥的市場(chǎng)十分龐大并不斷擴(kuò)張。雖然農(nóng)藥的使用有效地避免了農(nóng)作物的病蟲害，提高了產(chǎn)量，但隨著農(nóng)藥的使用范圍不斷擴(kuò)大，其對(duì)于環(huán)境的污染和動(dòng)植物的危害也顯露出來(lái)，直接威脅著人類的健康。

　　化學(xué)合成農(nóng)藥是應(yīng)用最廣泛、毒副作用最顯著的一類農(nóng)藥，包括有機(jī)磷類、有機(jī)氯類、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類等[2]。這類農(nóng)藥化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、半衰期長(zhǎng)并且能夠在自然界長(zhǎng)期存在并蓄積[3]，從而引起環(huán)境污染。據(jù)研究報(bào)道，在地下水、地表水[4]、土壤[5]、空氣[6]和高海拔地區(qū)[7]都能檢測(cè)到這類農(nóng)藥。化學(xué)合成農(nóng)藥還表現(xiàn)出廣泛的毒性，有機(jī)磷農(nóng)藥和有機(jī)氯農(nóng)藥具有強(qiáng)的神經(jīng)、消化、內(nèi)分泌、生殖系統(tǒng)等[8-15]毒性。擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類殺蟲劑雖然毒性較小，但也被報(bào)道能夠增加多種疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)[16-18]。

　　農(nóng)藥殘留對(duì)人類的健康造成了極大的威脅，對(duì)其進(jìn)行有效檢測(cè)成為保障人類健康安全的重要環(huán)節(jié)。但常規(guī)的檢測(cè)手段操作復(fù)雜、等待時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)成本昂貴[19]，無(wú)法滿足農(nóng)殘?jiān)�位檢測(cè)的需要。因此開發(fā)靈敏度高、特異性好、耐用性強(qiáng)的便攜快速檢測(cè)方法對(duì)微量甚至是痕量的農(nóng)殘進(jìn)行有效監(jiān)控已成為農(nóng)藥檢測(cè)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)及難點(diǎn)之一。合成生物學(xué)作為一門新興科學(xué)，通過(guò)基因編輯手段和工程化思維對(duì)生物體進(jìn)行改造與創(chuàng)新，常被稱作變革性的工具。

　　其獨(dú)特的創(chuàng)造性近幾十年來(lái)給多個(gè)領(lǐng)域和行業(yè)帶來(lái)了新的生機(jī)與活力。以環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域?yàn)槔�，利用合成生物學(xué)改造出的菌株能夠有效檢測(cè)和降解多種環(huán)境污染物[20-22]，其中包括對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。合成生物學(xué)能夠?qū)�傳統(tǒng)的生物傳感器、農(nóng)殘誘導(dǎo)操縱子等響應(yīng)部件和輸出不同信號(hào)的報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行多樣化組合，激發(fā)傳統(tǒng)生物檢測(cè)技術(shù)的新潛能，為多種農(nóng)殘的檢測(cè)提供新的思路與方法。原位檢測(cè)農(nóng)殘的特點(diǎn)更是傳統(tǒng)檢測(cè)手段無(wú)法比擬的，高靈敏度和多輸出信號(hào)也打破了農(nóng)殘檢測(cè)的固有局限，拓寬了檢測(cè)的應(yīng)用范圍。對(duì)比傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，本文歸納與總結(jié)當(dāng)前合成生物學(xué)技術(shù)在農(nóng)殘檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用與創(chuàng)新，分析其具有的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)。

　　1傳統(tǒng)檢測(cè)方法

　　目前檢測(cè)農(nóng)藥殘留的傳統(tǒng)方法大致可分為兩類：一類是以色譜法、質(zhì)譜法、光譜法以及酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等方法為代表的常規(guī)方法。這些方法能夠提供可靠的分析結(jié)果。但操作費(fèi)時(shí)、預(yù)處理復(fù)雜、成本昂貴且需要使用大量的有機(jī)溶劑，因此不適用于針對(duì)大量樣品的檢測(cè)工作[23]。另一類則是基于各種生物傳感器等先進(jìn)檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低且適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但高昂的開發(fā)成本限制了其在現(xiàn)階段的應(yīng)用。

　　1.1傳統(tǒng)的波譜檢測(cè)技術(shù)

　　1.1.1氣相色譜法

　　氣相色譜(GC)適用于分析非極性、易揮發(fā)且易汽化的化合物。其通常與特定的檢測(cè)器結(jié)合用于不同農(nóng)藥檢測(cè)，表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能[24]，如電子捕獲檢測(cè)器(ECD)適用于檢測(cè)鹵代化合物，火焰光度檢測(cè)器(FPD)主要用于測(cè)定含硫和磷的農(nóng)藥化合物，氮磷檢測(cè)器(NPD)對(duì)含有氮和磷的農(nóng)藥有極高的選擇性，而火焰離子化檢測(cè)器(FID)則幾乎適用于各種農(nóng)藥的檢測(cè)[25]。

　　1.2酶聯(lián)免疫吸附法

　　酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法因其低成本、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而被格外重視。該方法基于抗原-抗體間的特異性相互作用，因此能為某些農(nóng)藥提供特異性極高的檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)，該方法能夠一次性裝載大量樣品，極大地簡(jiǎn)化了樣品的處理程序[27]。單鏈抗體(scFvs)和納米抗體(VHHs)等小抗體與特定蛋白進(jìn)行融合產(chǎn)生的新型酶聯(lián)免疫吸附方法也開始出現(xiàn)[28,29]，常見(jiàn)的設(shè)計(jì)為抗體-堿性磷酸酯酶(AP)融合體。

　　這種融合表達(dá)設(shè)計(jì)能夠省去二抗的步驟，是一種簡(jiǎn)單快速的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法。該法已被應(yīng)用于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥[28,30,31]、有機(jī)磷類農(nóng)藥[32-34]的檢測(cè)。但該技術(shù)特異性較差，對(duì)于特定農(nóng)藥檢測(cè)的專一性不夠強(qiáng)，無(wú)法勝任未知樣品的農(nóng)殘檢測(cè)[35]。

　　1.3毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳法(CE)對(duì)樣品量要求較低、分離效率高且耗時(shí)短。但毛細(xì)管內(nèi)徑較小，在檢測(cè)中只允許少量進(jìn)樣，因此在靈敏度方面有一定的欠缺，一般與高靈敏度的檢測(cè)方法(如MS)聯(lián)用以彌補(bǔ)不足[36]，或者通過(guò)更高效的樣品濃縮方法來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度[37]。該方法與色譜法及ELISA相比，進(jìn)一步提高了檢測(cè)效率并降低了成本。

　　1.4表面增強(qiáng)拉曼光譜法表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)法具有快速測(cè)定食品中農(nóng)藥殘留的能力，其靈敏度極高且操作方便。目前已經(jīng)開發(fā)出多種SERS檢測(cè)方法：原位SERS方法，可直接檢測(cè)植物表面的農(nóng)藥殘留[38,39];以納米銀粒子為基質(zhì)的SERS方法無(wú)需樣品處理即可檢測(cè)飲料樣品[40];結(jié)合表面拭子的SERS方法可對(duì)水果表面殘留的農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)[41]。但使用該方法需建立不同農(nóng)藥分子的光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)農(nóng)藥的代謝物、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物等進(jìn)行光譜學(xué)的研究。

　　1.5傳統(tǒng)的無(wú)細(xì)胞生物傳感器法傳統(tǒng)的無(wú)細(xì)胞生物傳感器基于配體-受體特異性結(jié)合的原理，將待檢測(cè)物的含量、種類等信息通過(guò)不同的方法轉(zhuǎn)化為各種信號(hào)，從而達(dá)到定量檢測(cè)的目的[42-47]。這類方法與前述的方法相比集成度高、簡(jiǎn)單便攜且不依賴于精密儀器。

　　2應(yīng)用于農(nóng)殘檢測(cè)的合成生物學(xué)

　　近年來(lái)合成生物學(xué)模塊化、工程化思想逐漸應(yīng)用于農(nóng)殘檢測(cè)領(lǐng)域，本節(jié)將結(jié)合目前合成生物學(xué)在農(nóng)殘檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用，對(duì)其應(yīng)用原理進(jìn)行介紹。

　　2.1全細(xì)胞生物傳感器

　　合成生物學(xué)技術(shù)可以在細(xì)菌體內(nèi)構(gòu)建模塊化基因回路并建立起能夠檢測(cè)特定類型農(nóng)藥的全細(xì)胞生物傳感器。生物傳感器的構(gòu)建不再需要純化蛋白的復(fù)雜步驟，而是將整個(gè)細(xì)胞作為檢測(cè)器，大大節(jié)省了時(shí)間和成本。

　　2.1.1表面展示水解酶

　　當(dāng)前研究已報(bào)道了多種能夠降解特定農(nóng)殘的酶，如有機(jī)磷水解酶(OPH)[48]、甲基對(duì)硫磷水解酶(MPH)[49,50]、γ-六氯環(huán)己烷脫氫氯酶[51]等。這些酶能夠?qū)⑥r(nóng)殘降解為更易于檢測(cè)的小分子或特征化合物，通過(guò)檢測(cè)降解產(chǎn)物可以間接測(cè)定農(nóng)殘含量。

　　這些酶的發(fā)現(xiàn)及其基因鑒定是合成生物學(xué)的改造基礎(chǔ)。農(nóng)殘降解酶通常存在于土壤微生物體內(nèi)，但這些微生物往往繁殖能力弱、對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求高、產(chǎn)酶效率低，不適合作為全細(xì)胞生物傳感器的底盤細(xì)胞。合成生物學(xué)技術(shù)將原始宿主菌體內(nèi)的降解途徑轉(zhuǎn)移到易于進(jìn)行基因操作的細(xì)菌體內(nèi)，成功構(gòu)建出高效的農(nóng)殘檢測(cè)工程菌株[51]。同時(shí)為了避免農(nóng)藥低效的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及轉(zhuǎn)運(yùn)的損失，常通過(guò)表面展示系統(tǒng)將降解酶表達(dá)在菌體表面，利用體外催化的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)殘的降解與檢測(cè)[52-54]。除催化型的生物傳感器外，近些年利用重組基因技術(shù)在菌體表面展示抗體的農(nóng)殘檢測(cè)方法也開始出現(xiàn)[55]。

　　2.2無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)

　　無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)指的是構(gòu)造的工程化回路在無(wú)細(xì)胞底盤的類細(xì)胞系統(tǒng)中(含有細(xì)胞表達(dá)的必需成分)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[60]，其能精準(zhǔn)控制各組分的混合比例，與簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)建模相結(jié)合，檢測(cè)更加準(zhǔn)確。無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)的出現(xiàn)，規(guī)避了基因修飾微生物(GeneticallyModifiedOrganisms,GMOs)的釋放，避免了生物安全性問(wèn)題[61]，使得合成生物學(xué)應(yīng)用于農(nóng)殘的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)更為安全，更具實(shí)用性。

　　3合成生物學(xué)在農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用

　　3.1合成生物學(xué)應(yīng)用于有機(jī)氯農(nóng)藥的檢測(cè)

　　有機(jī)氯農(nóng)藥(OCs)是一類半衰期長(zhǎng)的合成有機(jī)化合物，常見(jiàn)的有機(jī)氯農(nóng)藥有二氯二苯基三氯乙烷(DDT)，林丹(γ-HCH)，阿特拉津，β-六氯環(huán)己烷(β-HCH)等。由于使用廣泛和半衰期較長(zhǎng)，OCs已成為環(huán)境中普遍存在的污染物[63]。對(duì)于有機(jī)氯農(nóng)藥，目前的主要檢測(cè)方法是氣相色譜-質(zhì)譜法、固相萃取色譜法等復(fù)雜精細(xì)的方法，這些方法費(fèi)時(shí)又昂貴，不適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。近些年來(lái)針對(duì)此類農(nóng)藥，已經(jīng)開發(fā)出一些極具潛力的合成生物學(xué)檢測(cè)方法。

　　3.1.1代謝礦化作用

　　檢測(cè)有機(jī)氯農(nóng)藥的主要思路是將難以直接檢測(cè)的有機(jī)物初步代謝為易于檢測(cè)的化合物。研究表明γ-六氯環(huán)己烷氯化氫酶通過(guò)三步脫氯作用，可初步降解林丹γ-HCH，并釋放三個(gè)HCl分子。聚苯胺的質(zhì)子化程度及其電導(dǎo)率隨pH的降低而增加，將HCH脫氯化氫酶(LinA2)基因?qū)�入大腸桿菌中表達(dá)，并將工程菌固定在可檢測(cè)pH變化的聚苯胺基質(zhì)中，施加0.4V電勢(shì)時(shí)，電流可隨pH的降低(HCl分子的產(chǎn)生)而增加，因而構(gòu)建出高靈敏度、選擇性強(qiáng)的林丹(γ-HCH)全細(xì)胞傳感器[51]。

　　4結(jié)語(yǔ)

　　合成生物學(xué)作為一門新興學(xué)科，在短短十多年間已經(jīng)取得了眾多突破性的進(jìn)展。目前研究者們已經(jīng)構(gòu)建了大量在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)可用的全細(xì)胞生物傳感器，也開發(fā)了一些更具實(shí)際應(yīng)用優(yōu)勢(shì)的無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)檢測(cè)方法，在多種農(nóng)藥的特異性檢測(cè)方面取得一定的研究成果。這些傳感器大多通過(guò)設(shè)計(jì)巧妙的特異性響應(yīng)，使得在特定農(nóng)藥分子存在時(shí)出現(xiàn)易于監(jiān)測(cè)的陽(yáng)性信號(hào)，大大方便了農(nóng)殘檢測(cè)[20]。

　　相比傳統(tǒng)方法，這些新方案存在諸多優(yōu)勢(shì)，其不需要大而昂貴的精密儀器，也不需要復(fù)雜的運(yùn)輸和前處理過(guò)程，更加具有現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、原位監(jiān)測(cè)的潛力，在商業(yè)化上也更有成本優(yōu)勢(shì)。但是，合成生物學(xué)在在農(nóng)藥檢測(cè)中的應(yīng)用尤其是全細(xì)胞傳感器仍然面臨著眾多挑戰(zhàn)。全細(xì)胞生物傳感器一般無(wú)法達(dá)到化學(xué)檢測(cè)的精度，而且在很多情況下由于報(bào)告基因的表達(dá)所需的時(shí)間而造成延長(zhǎng)響應(yīng)，此外如何在營(yíng)養(yǎng)缺乏甚至是含毒性化合物的環(huán)境下保存細(xì)胞活力也是必須考慮的問(wèn)題[88]。

　　生物學(xué)教學(xué)論文：淺談高中生物學(xué)科核心素養(yǎng)培養(yǎng)對(duì)策

　　針對(duì)上述問(wèn)題，研究人員試圖通過(guò)精制宿主植株[89]、設(shè)計(jì)更敏感的啟動(dòng)子[90]、使用表面展示的蛋白[91]等提高微生物傳感器的特異性、敏感性并減少響應(yīng)時(shí)間[92]。選擇水凝膠[93]等材料進(jìn)行封裝，提升安全性同時(shí)方便儲(chǔ)存。近年來(lái)各種各樣的合成生物學(xué)檢測(cè)方案正在進(jìn)行從實(shí)驗(yàn)室走向?qū)嶋H推廣應(yīng)用的嘗試。一方面這需要克服前文提到的檢測(cè)限、特異性和培養(yǎng)條件等限制，另一方面也必須考慮生物安全問(wèn)題。這不僅要求研究人員加強(qiáng)生物控制，也要求在應(yīng)用前對(duì)微生物衍生傳感器對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康的潛在影響進(jìn)行更系統(tǒng)的評(píng)估[88]。在未來(lái)，微生物傳感器也將向著更自動(dòng)化、更精細(xì)的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)展，具有廣大的前景[89]，合成生物學(xué)勢(shì)必在其中起到關(guān)鍵性的作用。

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　　作者：毛金竹1,3，肖淑玲1,2，楊智淳1,2，王孝宇1,4，張?jiān)?,5，陳俊宏1,2，謝佶晟1,2，陳福德1,2，黃子諾1,2，馮天宇1,2，張璦琿1,2,6，方柏山

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