高碳基肥減氮施用對土壤肥力和細菌多樣性的影響

　　摘 要 化肥過量施用導(dǎo)致土壤環(huán)境惡化，嚴重影響作物生產(chǎn)。高碳基肥在改善農(nóng)田土壤生態(tài)環(huán)境方面起到重要作用，對土壤肥力和微生物多樣性影響較大。本研究通過田間試驗，針對植煙土壤設(shè)置5個處理，NF (不施肥)、GCK (常規(guī)施肥純氮為111 kg/hm2)、G3 (高碳基肥料450 kg/hm2+99.9 kg/hm2純氮)(減氮10%)、G5 (高碳基肥料 750 kg/hm2+88.8 kg/hm2純氮)(減氮 20%)、G7 (高碳基肥料 1 050 kg/hm2+77.7 kg/hm2 純氮)(減氮30%)。采用高通量測序技術(shù)對土壤細菌多樣性進行分析和土壤化學(xué)成分測定，明確高碳基肥減氮施用對土壤肥力和細菌多樣性的影響。結(jié)果顯示，1)高碳基肥減氮施用能夠提高土壤pH、堿解氮、速效磷和 速效鉀的含量。移栽后 90 d，G7 處理的土壤 pH、堿解氮、速效磷和速效鉀分別提高了23.49%、8.78%、20.28%和27.81%。2)高碳基肥減氮施用對細菌多樣性影響較大。在門水平上，G7處理提高了變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度，在移栽后30和60 d分別比對照提高了9.93%和2.28%。G3處理在移栽后60 d提高了擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度，與對照相比提高了93.42%。高碳基肥減氮施用降低了酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度，其中G7處理在移栽后30 d降幅最大，相較于對照降低了35.39%。屬水平上，G7 處理在移栽后 30 和 60 d 提高了鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和假節(jié)桿菌屬(Pseudarthrobacter)的相對豐度，在移栽后60 d降低了產(chǎn)黃桿菌屬(Rhodanobacter)的相對豐度。整體來看，G7 處理對細菌多樣性影響較大。3)冗余分析(redundancy analysis, RDA)表明，土壤pH、速效鉀、速效磷和堿解氮均與變形菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)呈正相關(guān)關(guān)系。施用1 050 kg/hm2高碳基肥+77.7 kg/hm2純氮(減氮30%)對土壤肥力改善效果最優(yōu)，對土壤細菌多樣性影響較大。本研究為進一步探究高碳基肥減氮施用改良土壤及其對土壤微生物多樣性的影響提供了科學(xué)線索。

　　關(guān)鍵詞 高碳基肥;減氮施用;細菌多樣性;植煙土壤

　　生物炭是生物質(zhì)在無氧或缺氧條件下高溫?zé)峤猱a(chǎn)生的富含碳的固體殘渣，部分生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可燃氣體、揮發(fā)油和焦油(Lehmann, Joseph, 2009)。生物炭在土壤改良和固碳減排中起到重要作用。生物炭可以改善土壤物理特性，如提高土壤孔隙度、降低土壤容重(王歡歡等, 2017)和保持土壤水分(Liang et al., 2006)。

　　其次，生物炭中穩(wěn)定的芳香結(jié)構(gòu)極難降解(Cheng et al., 2015)，即使在有利的環(huán)境和生物條件下，生物炭也不容易以二氧化碳的形式返回到大氣中。生物炭還可以降低無機氮的流失，提高作物的養(yǎng)分利用效率(Steiner et al., 2010)，提高土壤pH (吳嘉楠, 2018)，減少N2O和CH4等溫室氣體的排放(Spokas et al., 2009)，降低重金屬有效性等作用(Song et al., 2021)。此外，生物炭對土壤微生物的數(shù)量、多樣性以及群落結(jié)構(gòu)影響較大(李怡博等, 2021; Hua et al., 2021)。

　　田間施用生物炭能增加微生物中氧化亞氮還原酶(nitrous oxidereductase, nosZ)基因豐度，促進N2O轉(zhuǎn)化為N2，從而降低 N2O 排放(Duan et al., 2019)。因此，農(nóng)田生物炭施用是土壤改良和固碳減排的重要措施(陳溫福等, 2013; Lehmann, Joseph, 2009)。生物炭基肥施用是提高土壤氮素存儲和作物利用效率、緩解溫室效應(yīng)的重要措施之一(魏春輝等, 2016)。高碳基肥是以生物炭為主體的新型有機肥料，由生物炭(添加量為20%)、植物油粕、天然礦物質(zhì)肥、腐殖酸、微量元素等原料組成(李文淵等, 2018)，有機養(yǎng)分和無機礦物質(zhì)營養(yǎng)均衡，大中微量元素營養(yǎng)均衡，是“濃香型特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)重大專項”的轉(zhuǎn)化成果(李文淵等, 2018)。生物炭與化肥配施可以補償土壤有機氮礦化的減少，并有助于調(diào)控氮的儲存和利用(Prommer et al., 2014)。

　　高碳基肥對土壤微生物代謝和多樣性有著重要影響。張志浩等(2019)采用Biolog微平板法研究不同用量高碳基肥對土壤微生物碳代謝活性和群落多樣性指數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)高碳基肥(1500 kg/hm2)能提高微生物多樣性指數(shù)以及微生物對聚合物類、氨基酸類、羧酸類和碳水化合物類碳源利用率。Zhang等(2018)采用16S rRNA測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，高碳基肥能提高土壤中非優(yōu)勢類群微生物豐度，如鞘脂菌屬和孢囊桿菌屬(α-變形菌)、紫色桿菌屬(β-變形菌)、水霉屬(γ-變形菌)和亞硝基菌屬(硝化細菌類)。

　　生物炭在改善農(nóng)田土壤生態(tài)環(huán)境方面起到重要作用，以生物炭為原料研發(fā)的高碳基肥對土壤微生物多樣性影響較大。然而，高碳基肥對植煙土壤肥力和微生物多樣性的影響尚不明確。因此，本研究通過測定高碳基肥減氮施用對重慶市豐都縣植煙土壤化學(xué)性質(zhì)影響，并利用高通量測序技術(shù)分析其對土壤細菌群落的影響，探討高碳基肥減氮施用下土壤化學(xué)成分與細菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系，為明確高碳基肥對土壤微生物多樣性的影響提供科學(xué)線索。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗地概況和材料實驗

　　于2020年5~10月在重慶市豐都縣武平基地單元太平壩示范區(qū)進行。試驗田地理位置為東經(jīng)29°44′10″，北緯108°9′27″，海拔1 514 m。氣候類型為亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，降雨量充沛，氣候溫和，年平均氣溫為17.3 ℃，常年降雨量在1 000 mm 以上，年平均日照1 333.3 h，無霜期230 d左右。實驗土壤為黃壤土，實驗品種為'云煙116' (Nicotianata⁃bacum cv. Yunyan 116)，供試土壤有機質(zhì) 42.6 g/kg，堿解氮 215 mg/kg、有效磷 51.6 mg/kg、速效鉀 431mg/kg，pH值為5.00。高碳基肥由河南惠農(nóng)土質(zhì)保育研發(fā)有限公司提 供 。 高 碳 基 肥 含 總 碳 (C) 27.09%、總 氮 (N)1.74%、磷 (P2O5) 1.28%、鉀 (K2O) 0.86%、含 水 率26.36% 、pH 8.19，由河南百恩信檢測技術(shù)有限公司檢測。

　　1.2 實驗設(shè)計

　　實驗設(shè)置5個處理分別為，NF (不施肥)、GCK：常規(guī)施肥純氮量為 111 kg/hm2、G3 (高碳基肥料450 kg/hm2+99.9 kg/hm2純氮)(減氮10%)、G5 (高碳基肥料 750 kg/hm2+88.8 kg/hm2純氮) (減氮 20%)、G7 (高碳基肥料1050 kg/hm2+77.7 kg/hm2純氮)(減氮 30%)。采用過磷酸鈣和硫酸鉀調(diào)控磷鉀含量。每個處理 3 次重復(fù)，小區(qū)隨機排列，設(shè)保護行。行距 1.15 m，株距 0.52 m，小區(qū)面積為 147 m2。常規(guī)施肥(N∶P2O5∶K2O=1∶0.95∶3.37)，高碳基肥在移栽前隨基肥條施，其他田間管理措施按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進行。

　　1.3 土壤樣品

　　采集分別于移栽 30、60 和 90 d 采集土壤樣品。采用抖落取樣法(Hua et al., 2021)采集煙草根際土壤，采集時去除表層 0~5 cm 土壤，并剔除石塊和動植物殘體后，采集煙草根系周圍土壤，放入自封袋后用干冰將采集的樣品放至-80 ℃保存。

　　1.4 樣品測定土壤樣品

　　各指標(biāo)參照《土壤農(nóng)化分析》中的方法進行測定(鮑士旦, 2000)。采用堿解擴散法測定土壤堿解氮含量;采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗顯色分光光度法測定土壤速效磷含量;采用火焰光度法測定土壤速效鉀含量;采用電位法測定土壤pH。土壤微生物16S rRNA測序由上海歐易生物技術(shù)有限公司的 Illumina MiSeq 平臺完成。采用DNA 抽提試劑盒(DNeasy PowerSoil K)(QIAGEN,美國)提取土壤樣本的基因組DNA，通過高通量測序?qū)ν寥兰毦?16S rRNA 的V3 和V4 區(qū)進行測定。

　　PCR擴增引物為：F：5'-TACGGRAGGCAGCAG-3';R：5'-AGGGTATCTAATCCT-3'。PCR 反應(yīng)體系(30μL)：2×G flex PCR Buffer 15 μL，1.25 U/μL TksGflex DNA Polymerase 0.6 μL，5 pmol/μL 正、反向引物各 1 μL，DNA 模板取 50 ng (≥1 μL)，ddH2O 補充至 30 μL。PCR 擴增條件為 94 ℃ 5 min;94 ℃30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，7個循環(huán);72 ℃ 5 min。

　　1.5 數(shù)據(jù)分析測序

　　數(shù)據(jù)進行預(yù)處理之后，采用Vsearch 2.4.2軟件，將相似性≥97%的序列歸為一個操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)單元，并將所有代表序列與數(shù)據(jù)庫進行比對注釋。利用 QIIME1.8.0 軟件對得到的序列進行 α 多樣性(α diversity)分析。土壤細菌群落結(jié)構(gòu)分析采用主成分分析方法，利用 OriginPro 2021 軟件進行冗余分析(redun‐dancy analysis, RDA)。使用 DPS 7.05 軟件進行方差分析，采用Tukey氏固定差距檢驗法和最小顯著差數(shù)法(least significant difference, LSD)進行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗，數(shù)據(jù)使用Excel 2019軟件進行處理。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 高碳基肥減氮施用對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

　　高碳基肥減氮施用對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響。高碳基肥減氮施用提高了土壤堿解氮的含量。移栽后 30 d，土壤的堿解氮含量表現(xiàn)為G5>G3>G7>GCK>NF，其中G5處理含量最高，比GCK增加了44.47%;移栽后60 d，堿解氮含量表現(xiàn)為 G3>G5>NF>GCK>G7，其中 G3 處理含量最高，比 GCK 顯著增加了 51.92% (P<0.05);移栽后90 d，堿解氮含量表現(xiàn)為G5>G7>NF>GCK>G3，其 中 G5 和 G7 處 理 分 別 增 加 了 47.05% 和8.78% (P<0.05)。高碳基肥減氮施用提高了土壤速效磷的含量。

　　移栽后30 d，土壤的速效磷含量表現(xiàn)為 G7>G3>GCK>G5>NF，其中 G7 處理含量最高，比 GCK 增加了 19.70%;移栽后 60 d，速效磷含量表現(xiàn)為 G5>GCK>G7>NF>G3，其中 G5 處理含量最高，比 GCK 增加了 13.99%;移栽后 90 d，速效磷含量表現(xiàn)為 G7>GCK>G5>G3>NF，其中G7處理含量最高，比GCK增加了20.28%。高碳基肥減氮施用對不同時期土壤速效鉀的含量影響有差異。移栽后 30 d，土壤的速效鉀含量表現(xiàn)為G7>GCK>G3>G5>NF，其中G7處理含量最高，比 GCK 增加了 5.35%;移栽后 60 d，速效鉀含量表現(xiàn)為 GCK>G5>G7>G3>NF;移栽后 90 d，速效鉀含量表現(xiàn)為 G7>G5>GCK>G3>NF，其中 G7處理含量最高，比GCK增加了27. 81%。

　　高碳基肥減氮施用提高了土壤pH。移栽后30 d，土壤pH表現(xiàn)為 G7>G3>G5>GCK>NF，其中 G7 處理含量pH最高，比GCK提高了14.36%;移栽后60 d，土壤pH表現(xiàn)為G3>G7>G5>GCK>NF，其中G3處理pH最高，比GCK提高了17.19%;移栽后90 d，土壤pH表現(xiàn)為G7>G3>G5>GCK>NF，其中G7處理pH 最高，比 GCK 提高了 23.49%。以上表明，高碳基肥減氮施用提高了土壤pH、堿解氮、速效磷和速效鉀的含量，其中G7處理提升土壤肥力效果較好。

　　2.2 土壤細菌16S rRNA測序和α多樣性指數(shù)分析

　　對移栽后 30、60 和 90 d 的 5 個處理的 45 個土壤樣品進行16S rRNA 測序，基于97%的序列相似度進行聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測序獲得的3 018 279條有效序列，可以分為14 667個OTUs，樣本序列讀數(shù) 的 平 均 長 度 為 412.15~415.85 bp。 覆 蓋 度 在0.971 3~0.978 2之間，測序深度包含了樣本中大部分微生物，測序數(shù)據(jù)合理。

　　不同處理的土壤細菌屬水平的群落結(jié)構(gòu)如圖4A 所示。移栽后 30 d，與 GCK 相比，高碳基肥減氮處理提高了鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、假節(jié)桿菌屬(Pseudarthro⁃bacter)、黃色桿菌屬(Pseudolabrys)和馬賽菌屬(Mas⁃silia)的相對豐度。其中，G7處理提高了鞘氨醇單胞菌屬、假節(jié)桿菌屬(Pseudarthrobacter)和馬賽菌屬(Massilia)的相對豐度(分別為 23.64%, 28.32% 和90.30%);G3 處理提高了芽單胞菌屬的相對豐度(39.65%);G5 處理提高了黃色桿菌屬相對豐度(16.97%)。

　　移栽后 60 d，與 GCK 相比，高碳基肥減氮處理提高了鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Can⁃didatus_Solibacter、溶桿菌屬(Lysobacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)和非優(yōu)勢屬類相對豐度，降低了產(chǎn)黃桿菌屬(Rhodanobacter)、芽胞桿菌屬(Bacillus)和布氏桿菌屬(Bryobacter)的相對豐度。其中，G7 處理提高了鞘氨醇單胞菌屬、Candidatus_Solibacter和擬桿菌 屬 相 對 豐 度 ( 分 別 為 73.00%, 205.71% 和111.54%);G5 處理提高了芽單胞菌屬和溶桿菌屬(Lysobacter)相對豐度(分別為 73.58% 和 140.04%)。

　　G7處理降低了產(chǎn)黃桿菌屬和芽胞桿菌屬(Bacillus)相對豐度(50.79% 和 50.78%);G3 處理降低了布氏桿菌屬(Bryobacter)相對豐度(37.64%)。移栽后 90d，與GCK 相比，高碳基肥減氮施用提高了鞘氨醇單胞菌屬、黃色桿菌屬、鞘脂菌屬(Sphingobium)和擬桿菌屬豐度，降低了Candidatus_Solibacter相對豐度。其中，G3處理提高了鞘氨醇單胞菌屬和鞘脂菌屬的相對豐度(分別為18.18%和49.90%);G7處理提高了黃色桿菌屬和擬桿菌屬的相對豐度(分別為 30.14% 和 446.19%)。G5 處理降低了 Candida⁃tus_Solibacter相對豐度(22.61%)。

　　3 討論

　　3.1 高碳基肥減氮施用對土壤理化性質(zhì)的影響

　　近年來，高碳基肥在植煙土壤改良中廣泛使用。具有改良土壤物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的作用和改善土壤微生態(tài)環(huán)境，提升煙葉產(chǎn)量與品質(zhì)等效果(張珂等, 2016)。高碳基肥中的有機質(zhì)和生物炭占比較大，為植物提供所需的速效養(yǎng)分和各種微量元素(張軍等, 2015, 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 43(11): 146-149)。

　　高碳基肥呈堿性，其田間施用提高了土壤pH，這與宋小寧(2018)研究結(jié)果一致。高碳基肥減氮施用提高了土壤堿解氮(移栽后30 d)、速效磷和速效鉀(移栽后90 d)的含量，說明在減氮情況下高碳基肥施用可以給植物生長提供充足的養(yǎng)分。其原因是高碳基肥中所含有的生物炭具有豐富的孔隙度和較大的比表面積，能夠有效地吸持各種鹽基陽離子和磷酸根離子，降低了土壤氮素損失，增加土壤養(yǎng)分的固持能力(Gaskin et al., 2008)。

　　3.2 高碳基肥減氮施用對土壤細菌多樣性和群落組成的影響

　　土壤微生物廣泛參與肥料的轉(zhuǎn)化和養(yǎng)分循環(huán)(殷全玉等, 2009)，其多樣性對植物地上部分生物量也有著重要的影響(Yang et al., 2021 )。本研究結(jié)果表明，高碳基肥減氮施用能提高土壤細菌多樣性和豐富度，在不同處理中細菌多樣性和豐富度指數(shù)變化趨勢不同。推測是高碳基肥引起的土壤的養(yǎng)分變化，影響了土壤細菌的群落結(jié)構(gòu)(Lehmann et al., 2011)。高碳基肥特殊的孔隙結(jié)構(gòu)為土壤微生物提供了良好的棲息環(huán)境，吸附和存儲的物質(zhì)為微生物提供了充足的養(yǎng)分，利于土壤微生物繁殖(饒霜等, 2016; Lehmann et al., 2003)，進而影響了土壤細菌群落的組成和結(jié)構(gòu)(Farrell et al.,2013)。

　　本研究中，高碳基肥減氮施用G3處理提高了土壤細菌的豐富度和多樣性(移栽后60和90 d)，然而G5處理降低了土壤細菌的多樣性(移栽后30和 90 d)，這可能與高碳基肥的施用量有關(guān)。殷全玉等(2021)研究發(fā)現(xiàn)隨著生物炭用量的增加，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異先增大后減小，說明高碳基肥用量對土壤微生物的多樣性影響較大。本研究中土壤細菌的豐富度和多樣性隨著煙草生長逐漸升高，在移栽后90 d達到峰值，其可能原因是移栽后30~90 d，煙草根系逐漸發(fā)育，其分泌的有機物有利于根際微生物的生長(朱麗霞等, 2003)。高碳基肥對土壤微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)有較大影響(Lin et al., 2017)。

　　本研究中不同處理中 Top 10 的優(yōu)勢細菌門類包括變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門和厚壁菌門等，這與高碳基肥對舞陽縣植煙土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響研究結(jié)果相近(Zhang et al., 2018)。高碳基肥減氮施用提高了變形菌門和擬桿菌門相對豐度。變形菌門和擬桿菌門均為富營養(yǎng)菌，土壤有機質(zhì)的增加能提高其豐度(Fierer et al., 2012)。其中，變形菌門是土壤碳激發(fā)效應(yīng)的主要“參與者”(Zhao etal., 2022)，因此高碳基肥減氮施用可能通過影響變形菌門相對豐度，參與了土壤碳循環(huán)。

　　4 結(jié)論

　　本研究通過對不同高碳基肥減氮施用處理下豐都縣植煙區(qū)土壤化學(xué)成分測定以及土壤細菌多樣性的高通量測序分析，發(fā)現(xiàn)高碳基肥減氮施用能提高土壤肥力，增加土壤細菌多樣性和豐富度，改變細菌群落結(jié)構(gòu)。在門水平上，高碳基肥減氮施用提高了變形菌門和擬桿菌門相對豐度，降低了酸桿菌門相對豐度。

　　在屬水平上，高碳基肥減氮施用增加了植物根際促生菌(鞘氨醇單胞菌屬)、假節(jié)桿菌屬和鞘脂菌屬的相對豐度，降低了反硝化細菌(產(chǎn)黃桿菌屬)的相對豐度。土壤 pH、堿解氮、速效磷和速效鉀對豐都植煙土壤細菌群落組成影響較大。每公頃施用高碳基肥料 1 050 kg/hm2+77.7 kg/hm2純氮(減氮30%)對土壤肥力改善效果最優(yōu)，對土壤細菌多樣性影響較大。

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　　作者：蘇夢迪1 馬嘯2 胡麗濤2 趙龍杰2 彭軍2 王歡歡1 張松濤1*

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