川椒抑制木材腐朽菌性能研究

　　摘要：本試驗采用超聲輔助回流法提取川椒有效抑菌成分，以彩絨革蓋菌和密粘褶菌的菌絲生長抑制率為指標(biāo)進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化。采用了響應(yīng)面分析法確定川椒提取的最佳工藝條件，同時探討了液料比、乙醇濃度、提取時間和溫度間的顯著性影響和交互作用。當(dāng)乙醇濃度95%，液料比12∶1，超聲時間40. 00 min，超聲溫度45. 0℃，對彩絨革蓋菌生長抑制率為26. 35%;當(dāng)乙醇濃度95%，液料比20∶1，超聲時間53. 00 min，超聲溫度65. 0℃，對密粘褶菌生長抑制率為66. 13%;當(dāng)乙醇濃度95%，液料比20∶1，超聲時間59. 00 min，超聲溫度65. 0℃，彩絨革蓋菌生長抑制率為21. 39%，密粘褶菌生長抑制率為63. 54%。

　　關(guān)鍵詞：川椒;響應(yīng)面法;彩絨革蓋菌;密粘褶菌;菌絲生長速率法

　　木材力學(xué)性能好、利于加工及可再生等優(yōu)勢使木材在多個領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1]。但木材作為一種生物質(zhì)材料，易受到微生物的侵蝕，引起其理化性能的改變，影響木材的正常使用，高效低毒的環(huán)境友好型木材防腐藥劑是現(xiàn)在木材防腐研究的重點和發(fā)展的方向[2-3]。川椒為蕓香科植物青椒(香椒、青花椒、山椒、狗椒)(Zanthoxylum schinifolium Sieb. et Zucc.)或花椒(蜀椒、川椒、紅椒、紅花椒、大紅袍)(Zanthoxylumbungeanum Maxim.)的干燥成熟果皮[4]。

　　研究證實，川椒提取物中含有多種抑菌活性成分，如揮發(fā)油、酰胺、生物堿、黃酮類等成分[5-9]，具有廣譜抑菌作用。目前，有研究表明川椒提取物中的揮發(fā)油等活性成分能夠能降低細(xì)胞膜的完整性，抑制孢子萌發(fā)，抑制真菌生長[10]。因此，川椒提取物適合作為一種環(huán)境友好型生物抑菌劑。本研究以川椒為研究對象，以引起木材白腐的彩絨革蓋菌(Trametes versicolor(L.)Lloyd)和引起木材褐腐的密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum(Pers.)Murrill)作為供試菌種，以提取物對菌絲生長抑制率為指標(biāo)，采用單因素試驗確定了乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度等因素的最優(yōu)提取條件[11]，并采用 CCD 響應(yīng)面法設(shè)計試驗并進(jìn)行了川椒提取工藝的優(yōu)化與分析。

　　木材加工論文：植物源木材防腐劑增效技術(shù)研究進(jìn)展

　　1 材料與方法

　　1. 1 材料與儀器

　　1. 1. 1 材料川椒購買于呼和浩特市國大藥房，原產(chǎn)地為四川省，生產(chǎn)日期為 2018年 9月，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國藥典》(2015版)，實驗室陰干，粉碎后過80目篩備用。供試菌種：彩絨革蓋菌，菌種購于中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所;密粘褶菌，菌種購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，均經(jīng)實驗室培養(yǎng)活化放置恒溫恒濕箱備用。主要試劑：無水乙醇(分析純)、葡糖糖、瓊脂。

　　1. 1. 2 儀器和設(shè)備TGCXZ-2B 超聲循環(huán)提取機(jī)，北京弘祥隆生物技術(shù)股份有限公司;BSC-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;YTSP-840超凈工作臺，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司。

　　1. 2 試驗方法

　　1. 2. 1 川椒提取物的帶毒培養(yǎng)基的制備川椒粉碎后過篩，超聲提取后抽濾分離，進(jìn)行索氏抽提，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后去除多余溶劑，得到川椒提取物浸膏，取一定量浸膏加入到冷卻至40℃~50℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)中，搖勻后倒入培養(yǎng)皿中，冷卻備用。

　　1. 2. 2 川椒提取物的抑菌活性測定試驗采用生長速率法[12]測定川椒提取物對2種常見木材腐朽菌的菌絲生長抑制作用。用直徑為4mm 的打孔器取無菌水培養(yǎng)菌落邊緣菌餅，將菌餅反向移植在帶毒培養(yǎng)基中心培養(yǎng)，每種試樣設(shè) 3 次重復(fù)。將接種后培養(yǎng)皿放置在溫度為 28℃，濕度80%的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)。從第3天起開始記錄菌落直徑。菌絲生長抑制率按照以下公式進(jìn)行計算：菌落生長直徑(mm)=兩次直徑平均值−4. 0(菌餅直徑)菌絲生長抑制率=(對照菌落生長直徑−處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100%。

　　1. 2. 3 超聲輔助回流法提取川椒單因素試驗按照試驗設(shè)計，分別研究乙醇濃度、液料比、超聲時間和超聲溫度對川椒提取物抑菌效果的影響：乙醇濃度濃度為55%、65%、75%、85%、95%;液料比為 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1;超聲時間為 20. 00min、30. 00 min、40. 00 min、50. 00 min、60. 00 min;超聲溫度為25. 0℃、35. 0℃、45. 0℃、55. 0℃、65. 0℃。其中，在進(jìn)行乙醇濃度、液料比、超聲時間試驗時，帶毒培養(yǎng)基的含藥濃度為25 mg/mL，在進(jìn)行超聲溫度試驗時，帶毒培養(yǎng)基濃度降低為15 mg/mL。

　　1. 2. 4 響應(yīng)面法優(yōu)化川椒抑菌物質(zhì)提取工藝根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，以乙醇濃度、液料比、超聲時間超聲溫度4個因素為變量，以菌絲生長抑制率為響應(yīng)值，結(jié)合 Central Composite 設(shè)計原理，采用 4 因素 5 水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗設(shè)計，利用 Design expert(V8. 0. 6)進(jìn)行試驗，此時設(shè)置帶毒培養(yǎng)基濃度為10 mg/mL，測定第3天時提取物培養(yǎng)基的抑制率。

　　2 結(jié)果與分析

　　2. 1 單因素試驗結(jié)果

　　2. 1. 1 乙醇濃度對川椒提取液抑菌效果的影響由圖1可知，乙醇濃度為95%時，彩絨革蓋菌的抑菌效果最好。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是隨著乙醇濃度的增加，溶劑的極性逐漸變大，脂溶性成分(如揮發(fā)油、脂類、萜類等)逐漸增多，抑菌效果逐漸增強(qiáng)[13]。以濃度為 100%乙醇作為浸提溶劑時，提取液對密粘褶菌的抑制率僅增加了 3. 88%，對彩絨革蓋菌的抑制率降低了 20. 18%，這可能是由于乙醇濃度越高溶出的物質(zhì)也越多，但隨著濃度的增加，雜質(zhì)也溶出來，影響抑菌效果[14]。因此，后續(xù)試驗選取95%乙醇作為浸提溶劑。

　　2. 1. 2 液料比對川椒提取液抑菌效果的影響不同液料比對川椒提取液的抑菌影響結(jié)果。液料比在 5∶1~15∶1之間時，抑菌效果隨著液料比的增加而增加，這可能是由于川椒粉末和乙醇溶液中的濃度差變大，提取物的擴(kuò)散空間擴(kuò)大，擴(kuò)散速度加快，使川椒中的有效抑菌物質(zhì)更加易于溶解出來，抑菌效果越好[15];當(dāng)液料比增加到20∶1時，一些非抑菌物質(zhì)也逐漸擴(kuò)散到溶劑中，影響提取物的抑菌效果[16]。因此，選擇最佳液料比為15∶1。

　　2. 1. 3 超聲時間對川椒提取液抑菌效果的影響超聲時間對川椒提取液的抑菌影響結(jié)果。川椒提取物的抑菌效果隨提取時間的增加而持續(xù)加大。這是由于超聲作用時間越長，破碎效用愈強(qiáng)勁，細(xì)胞的受損度就愈高，有效成分溶出就越多[17]�？紤]實際儀器的安全使用，選擇超聲時間60min進(jìn)行后續(xù)試驗。在乙醇濃度為 95%，液料比 15∶1，超聲時間60. 00 min的提取條件下，川椒提取液帶毒培養(yǎng)基濃度為 25 mg/mL 時，密粘褶菌的抑制率已經(jīng)達(dá)到了88. 14%，為了更好的確定超聲溫度對抑制率的影響，后續(xù)試驗帶毒培養(yǎng)基的濃度降低為15 mg/mL。

　　2. 1. 4 超聲溫度對川椒提取液抑菌效果的影響超聲溫度對川椒提取物的抑菌效果的影響，提取物的抑菌效果在 25. 0℃~55. 0℃時，隨著溫度的升高而增加，川椒中有效抑菌成分的溶解擴(kuò)散速度加快，溶出成分逐漸增多，抑菌效果逐漸增加[18]。當(dāng)超聲溫度到達(dá) 65. 0℃時，提取物對密粘褶菌的抑制效果出現(xiàn)了輕微減弱，這可能是由于溫度升高，對密粘褶菌有抑制作用的部分活性物質(zhì)受熱失活，抑制效果減弱[19]。超聲溫度 55. 0℃時，提取液中有效成分溶出較多對2種木材腐朽菌的抑制效果較好，因此選用 55. 0℃作為最佳超聲提取溫度。

　　2. 2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

　　根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，以乙醇濃度、液料比、超聲時間和超聲溫度4個因素為變量，以菌絲生長抑制率為響應(yīng)值，結(jié)合 Central Composite 設(shè)計原理，采用 4因素 5水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗設(shè)計，利用 Design expert(V8. 0. 6)進(jìn)行優(yōu)化分析。

　　川椒提取響應(yīng)面試驗，以彩絨革蓋菌生長抑制率和密粘褶菌生長抑制率2個值為響應(yīng)值。經(jīng)過軟件對川椒提取液菌絲生長抑制率曲面模型的分析，有如下結(jié)果：當(dāng)不考慮密粘褶菌生長抑制率，以彩絨革蓋菌生長抑制率為最大值時，最優(yōu)工藝條件為乙醇濃度為 95%，液料比為 11. 68∶1，超聲時間為40. 00 min，超聲溫度為 45. 0℃，預(yù)測彩絨革蓋菌生長抑制率達(dá)到最大值為 25. 47%;當(dāng)不考慮彩絨革蓋菌生長抑制率，以密粘褶菌生長抑制率為最大值時，最優(yōu)工藝條件為乙醇濃度為95%，液料比為 20∶1，超聲時間為 52. 52 min，超聲溫度為 65. 0℃，預(yù)測密粘褶菌生長抑制率達(dá)到最大值為 67. 92%;同時以彩絨革蓋菌生長抑制率、密粘褶菌生長抑制率為最大值時，最優(yōu)工藝條件為乙醇濃度為 95%，液料比 為 20∶1，超 聲 時 間 為 58. 90 min，超 聲 溫 度 為65. 0℃，預(yù)測彩絨革蓋菌生長抑制率達(dá)到最大值為2 0. 5 9%，預(yù)測密粘褶菌生長抑制率達(dá)到最大值為64. 61%。2. 3 最佳工藝條件的驗證試驗為了驗證響應(yīng)曲面結(jié)果的可靠性，根據(jù)實際實驗設(shè)備及條件，將得到的優(yōu)化工藝條件修正為：乙醇濃度為 95%，液料比為 12∶1，超聲時間為 40. 00min，超聲溫度為 45. 0℃，此時預(yù)測彩絨革蓋菌生長抑制率達(dá)到最大值為 25. 47%，按照此工藝條件進(jìn)行 3 次平行驗證試驗。

　　實際平均彩絨革蓋菌抑制率值為 26. 35%，比預(yù)測值高0. 88%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為0. 84%。當(dāng)乙醇濃度為 95%，液料比為 20∶1，超聲時間為 53. 00 min，超聲溫度為 65. 0℃，預(yù)測密粘褶菌生長抑制率達(dá)到最大值為 67. 92%，按照此工藝條件進(jìn)行 3 次平行驗證試驗，結(jié)果如下表 5 所示。實際平均密粘褶菌抑制率值為 66. 13%，比預(yù)測值低1. 79%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為1. 38%。當(dāng)乙醇濃度為 95%，液料比為 20∶1，超聲時間為 59. 00 min，超聲溫度為 65. 0℃，預(yù)測彩絨革蓋菌生長抑制率達(dá)到最大值為 20. 59%，預(yù)測密粘褶菌生長抑制率達(dá)到最大值為 64. 61%，按照此工藝條件進(jìn)行 3 次平行驗證試驗。實際平均彩絨革蓋菌生長抑制率達(dá)為 21. 39%，比預(yù)測值高0. 80%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為1. 82%，實際平均密粘褶菌生長抑制率為 63. 54%，比預(yù)測值低1. 07%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為0. 88%。試驗結(jié)果表明，該響應(yīng)曲面數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性。

　　3 結(jié)論

　　關(guān)于川椒的最優(yōu)提取工藝已有較多的文獻(xiàn)報道，但文獻(xiàn)多以川椒提取率為指標(biāo)對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，本試驗以乙醇濃度、液料比、超聲時間和超聲溫度為因素，對 2 種常見的木材腐朽菌的抑制率為指標(biāo)，確定了川椒的最優(yōu)提取工藝：當(dāng)乙醇濃度為 95%，液料比為 12∶1，超聲時間為 40. 00 min，超聲溫度為 45. 0℃，此時彩絨革蓋菌生長抑制率達(dá)到最大值，此時彩絨革蓋菌生長抑制率為 26. 35%;當(dāng)乙醇濃度為95%，液料比為20∶1，超聲時間為53. 00min，超聲溫度為 65℃，此時密粘褶菌生長抑制率達(dá)到最大值，此時密粘褶菌生長抑制率為 66. 13%，;當(dāng)乙醇濃度為 95%，液料比為 20∶1，超聲時間為59. 00 min，超聲溫度為 65. 0℃，此時彩絨革蓋菌生長抑制率和密粘褶菌生長抑制率達(dá)到最大值，實際平均彩絨革蓋菌生長抑制率為 21. 39%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 1. 82%，實際平均密粘褶菌生長抑制率為63. 54%。川椒的醇提物對2種常見的木材腐朽菌均具有一定的抑菌性能。試驗為川椒的多效開發(fā)利用提供了參考，也為植物源木材防腐劑提供了新思路，具有一定的實際應(yīng)用前景。

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　　作者：盛婧源，王長健，王雅梅*，任士明，趙曉琪

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