蛋白質(zhì)磷酸化對宰后肉品質(zhì)影響研究進展

　　摘要：畜禽肌肉在宰后變?yōu)榭墒橙獾倪^程中，需要經(jīng)過一系列的生化變化直到成熟，其中蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)作為一種蛋白質(zhì)的動態(tài)調(diào)控機制，幾乎調(diào)節(jié)每一個主要的生物過程，是生物界廣泛的翻譯后修飾之一。因此研究蛋白質(zhì)磷酸化與宰后肌肉的關(guān)系，有助于肉類食品行業(yè)的發(fā)展。本文以介紹蛋白質(zhì)磷酸化開始，討論了磷酸化蛋白質(zhì)檢測技術(shù)的進步，總結(jié)宰后肌肉中會發(fā)生磷酸化的蛋白質(zhì)及影響因素，從蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)與宰后肉的嫩度、肉的色澤和保水性三個方面的研究入手綜述了蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)對肉品質(zhì)的影響，以及食鹽與氨基酸在該過程中的應(yīng)用， 并對蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)在肉品品質(zhì)中的研究做出了展望。

　　關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)磷酸化;肉質(zhì);肉色;保水性;食鹽;氨基酸

　　在日常生活中，人體維持營養(yǎng)均衡的膳食不僅需要綠色的水果蔬菜，肉及肉制品的攝入也是必不可少的。果蔬可以為人體提供維生素、礦物質(zhì)和水分，但是供能營養(yǎng)素(蛋白質(zhì)、脂肪)主要來源于肉類食品，除此之外，肉類食品中也含有維生素和微量元素。我國作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，畜牧業(yè)已隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展越來越壯大，肉及肉制品的供給從短缺的狀況到能夠滿足人們?nèi)粘�營養(yǎng)膳食補充的需要[1]。作為全世界最大的肉制品生產(chǎn)和消費國，我國肉制品的年產(chǎn)量占全球總量的 1/4[2]。久而久之，人們對于肉及肉制品從數(shù)量的需要轉(zhuǎn)變成了對質(zhì)量的關(guān)注。肉及肉制品中含有豐富的、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)大分子，以氨基酸為單位，構(gòu)成元素有碳、氫、氧、氮、硫等，部分蛋白質(zhì)分子還含有鐵、碘、磷、鋅元素等。蛋白質(zhì)的功能特性(如保水性、凝膠特性及乳化性)，會對肉的品質(zhì)產(chǎn)生顯著的影響[3]。

　　肉的品質(zhì)(主要包括嫩度、顏色、風味、保水性等)除了與宰前動物的品種、年齡、健康狀況、肌肉部位、管理有關(guān)，也與宰后時間以及宰后環(huán)境(溫度、濕度等)有關(guān)，畜禽機體被宰殺后，肉并不是最終形態(tài)，肌肉內(nèi)的生理生化代謝活動仍在繼續(xù)，經(jīng)歷這段過程才能使畜禽內(nèi)部肌肉成熟變?yōu)榭墒橙狻Ｔ诟鞣N生命體的動態(tài)調(diào)控機制中，蛋白質(zhì)翻譯后修飾(protein translational modifications，PTMs)的作用顯著，真核生物中大約有三百多種修飾種類，包括蛋白質(zhì)乙酰化、泛素化、甲基化和磷酸化等，翻譯后修飾的蛋白質(zhì)不論是在結(jié)構(gòu)、功能特性、調(diào)節(jié)方式還是專一性方面，整體上都經(jīng)過了有效的正向調(diào)整[4,5]。蛋白質(zhì)修飾不僅影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，還能建立新的細胞功能，是復(fù)雜的細胞信號傳感和轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，這些不同的 PTMs 對受影響的蛋白質(zhì)及其參與的細胞過程可能產(chǎn)生許多不同的結(jié)果[6]。

　　而蛋白質(zhì)磷酸化(protein phosphorylation)是其中最常見的，是一種可逆的、快速的信號轉(zhuǎn)導和蛋白活性調(diào)控手段，可以調(diào)節(jié)多種生命活動，在特定的時間內(nèi)哺乳動物細胞中大約有三分之一的蛋白質(zhì)是經(jīng)過磷酸化修飾的[7,8]，在調(diào)節(jié)細胞分裂凋亡、介導細胞信號的傳導、復(fù)制DNA、表達和分化基因等過程中起著至關(guān)重要的作用，并且可以改變酶活性和其他生物活性[9]。在宰后肌肉的生理生化活動中，蛋白質(zhì)磷酸化對成熟肉的品質(zhì)有一定的影響，探究其影響的作用機制，可以將結(jié)果有效地運用到肉及肉制品的加工工藝中，生產(chǎn)美味營養(yǎng)又健康的肉類食品。

　　本文從介紹蛋白質(zhì)磷酸化的概念和檢測分析技術(shù)出發(fā)，對宰后肌肉中會發(fā)生磷酸化翻譯后修飾的蛋白質(zhì)和影響磷酸化水平的多種因素進行了總結(jié);然后圍繞蛋白質(zhì)磷酸化與宰后肌肉的嫩度、色澤與保水性的研究結(jié)果進行闡述;食鹽是蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響因素之一，但在食品減鹽的大背景下，堿性氨基酸在肉類食品加工中具有多項優(yōu)點，通過氨基酸對宰后肌肉中蛋白質(zhì)磷酸化的影響，為肉制品低鹽加工提供理論支持。

　　1 蛋白質(zhì)磷酸化的介紹

　　20 世紀 50 年代， Fischer 和 Krebs 兩位科學家在研究糖原的新陳代謝調(diào)控時發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)。蛋白質(zhì)磷酸化是指，在蛋白激酶的催化條件下，將腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)或三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate, GTP) γ 位上的磷酸基團，轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的過程，較多發(fā)生在絲氨酸(serine, Ser)、蘇氨酸(l-threonine, Thr)或酪氨酸(tyrosine, Tyr)等殘基側(cè)鏈的羥基上[10,11]。蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)是動態(tài)的、可逆的，因此控制該過程不僅需要一個蛋白激酶(proteinkinases, PK)，還需要一個蛋白質(zhì)磷酸酶(proteinphosphatase, PP)，兩者發(fā)揮各自的作用，以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的磷酸化或者去磷酸化的調(diào)控，進而達到研究的目的。

　　1994 年，Williams 和 Wilkins 學者聯(lián)系蛋白質(zhì)(protein)與基因組(genome)兩個概念，提出蛋白質(zhì)組(proteome)一詞，指“由一個細胞或一個組織基因組所能夠表達的全部蛋白質(zhì)”[13]。在肉品科學領(lǐng)域內(nèi)，蛋白質(zhì)組學的研究使科研人員能夠更好地了解肉品質(zhì)與不同品種[14]、基因型差異[15] 、持水的能力[16]以及成熟老化[17]的關(guān)系。蛋白質(zhì)組學是一個關(guān)鍵的工具，以揭示肌肉蛋白質(zhì)水平在宰后發(fā)生的生物化學變化。蛋白質(zhì)組學可以檢測畜禽宰后發(fā)生的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，可以對細胞或組織中蛋白質(zhì)磷酸化修飾的情況有較為整體的觀察，因此逐漸產(chǎn)生了磷酸化蛋白質(zhì)組學(phosphoproteomics)這一新概念[9]。

　　此后，在磷酸化蛋白質(zhì)組學的知識基礎(chǔ)上，生物學家們增加了新的研究思路，能夠更加全面地研究磷酸化蛋白質(zhì)在細胞或組織中的作用，研究蛋白質(zhì)磷酸化的發(fā)展上升了一個臺階。磷酸化蛋白質(zhì)研究和發(fā)展過程中的困難主要在于檢測和分析，發(fā)生磷酸化修飾的蛋白質(zhì)數(shù)量少，需要高精密度和高專一性儀器才能檢測出結(jié)果。即使磷酸化修飾的蛋白質(zhì)分子的表達量相對較高，但對蛋白質(zhì)的磷酸化修飾部分的分析依然困難，這是因為數(shù)據(jù)證明，磷酸化蛋白質(zhì)的部分僅占該全蛋白質(zhì)總量的 10%[18]。磷酸化蛋白質(zhì)組學研究的關(guān)鍵進展有賴于磷酸化蛋白質(zhì)的識別和鑒定技術(shù)。

　　常見檢測磷酸化蛋白質(zhì)的方法可以分為三類，磷酸化蛋白質(zhì)的富集、磷酸化蛋白質(zhì)分離技術(shù)以及磷酸化蛋白質(zhì)的定量和位點分析技術(shù)，磷酸化蛋白質(zhì)的富集有助于檢測儀器發(fā)現(xiàn)和鑒定，如免疫共沉淀法利于磷酸化蛋白與抗體結(jié)合性強有效富集磷酸肽，分離磷酸肽后可以獨立檢測，減少其他物質(zhì)的干擾，定量分析和位點測定可以對全蛋白質(zhì)組進行研究從而找到動態(tài)調(diào)控中的目標磷酸化蛋白質(zhì)和關(guān)鍵作用位點。蛋白質(zhì)磷酸化檢測技術(shù)是得出相關(guān)實驗結(jié)果必要的基礎(chǔ)，技術(shù)的進步隨著實驗所需和科技發(fā)展不斷發(fā)展，分析方法主要采用色譜、質(zhì)譜技術(shù)與其他手段聯(lián)用，各種方法均有各自的特點與局限性，根據(jù)具體的實驗需求選擇最佳的檢測技術(shù)。

　　2 磷酸化蛋白

　　基于質(zhì)譜的磷蛋白組學研究表明，很大比例的細胞蛋白(超過 6000 種蛋白)可以被磷酸化[31]。肌肉中的蛋白質(zhì)含量和種類多，在引發(fā)蛋白質(zhì)磷酸化影響肉品質(zhì)相關(guān)的思考后，科研人員開始了對肌肉內(nèi)發(fā)生磷酸化或去磷酸化的蛋白及影響因素的研究。肌鈣蛋白、肌球蛋白輕鏈和肌動蛋白等蛋白質(zhì)，都會發(fā)生磷酸化修飾，肌鈣蛋白和鈣蛋白酶抑制蛋白等的磷酸化可以降低蛋白的降解。James 等人[32]發(fā)現(xiàn)骨骼肌肌球蛋白輕鏈激酶可磷酸化肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈，改變肌球蛋白的結(jié)構(gòu)。同樣，Huang 等人[33,34]通過實驗表明，磷蛋白主要作為相關(guān)酶參與糖代謝活動，其余參與宰后應(yīng)激反應(yīng)、磷酸肌酸代謝，磷蛋白磷酸化水平的變化，會影響宰后肌肉 pH 下降速率。

　　Chen Li 等人[35]對宰后羊肌肉中肌漿蛋白磷酸化水平與糖酵解率的關(guān)系進行了研究，發(fā)現(xiàn)糖酵解速率與肌漿磷酸化水平呈負相關(guān)，并影響宰后早期肌肉 pH 值的下降。Li Zheng 等人[36]的實驗研究結(jié)果是肌原纖維蛋白的磷酸化水平的降低，會加速肌原纖維的斷裂。肌球蛋白重鏈、肌動蛋白和原肌球蛋白在宰后肌肉中降解困難，去磷酸化增強了部分肌原纖維蛋白的降解，推測出蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化水平的變化可能與宰后肌肉的嫩化密切相關(guān)。Li Zheng[37]也通過實驗表明肌原纖維蛋白和 μ-鈣蛋白酶可發(fā)生磷酸化，影響肌肉內(nèi)肌原纖維蛋白被 μ-鈣蛋白的降解，表明蛋白質(zhì)磷酸化在宰后肉的嫩化過程中發(fā)揮了重要作用。

　　蛋白質(zhì)磷酸化會對肉的品質(zhì)產(chǎn)生影響，研究影響蛋白和酶磷酸化的因素可為宰后肉加工提供可靠信息。此前有研究表明冰溫(冰點以上、0℃以下的溫度)儲藏對牛肉的嫩度有影響[39]。張艷等[40]測定了宰后羊肉分別在冰溫和冷藏條件下，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的磷酸化水平，即使冰溫條件下兩者的磷酸化水平變化趨勢相反，但磷酸化水平均低于冷藏處理組。張彩霞等人[41]也研究了羊肉肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的磷酸化水平分別在三個溫度(-1°C、4°C 和 25°C)下的變化，腌制溫度能夠正向調(diào)控肌漿蛋白的磷酸化水平，負向調(diào)控肌原纖維蛋白的磷酸化水平。Li Xiao 和 ZengXiaoming 等人[42,43]也研究了宰后豬肉肌原纖維蛋白和肌漿蛋白磷酸化水平在不同季節(jié)時的變化，該影響本質(zhì)上是通過溫度的變化改變糖酵解速率等間接起作用。

　　除了溫度的影響外，Li Chunbao 等[44]人研究了電刺激(electrical stimulation, ES)的處理方式對牛肉肌漿蛋白和肌原纖維蛋白磷酸化的影響，結(jié)果表明電刺激存在瞬時影響肌原蛋白的磷酸化水平的改變，但是肌漿蛋白磷酸化水平在 3h 后才會表現(xiàn)出受到了顯著影響。酶本身也會影響蛋白質(zhì)磷酸化，Cao Lichuang 等人[45]發(fā)現(xiàn)肌球蛋白輕鏈激酶和肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑可調(diào)節(jié)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈在 Ser17 位點的磷酸化狀態(tài)，影響肌動球蛋白的解離，調(diào)節(jié)肌肉收縮從而達到改善肉質(zhì)的目的。

　　3 蛋白質(zhì)磷酸化與肉品質(zhì)的關(guān)系

　　蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)自發(fā)現(xiàn)以來，更多研究應(yīng)用在醫(yī)學、生物化學等方面，而對蛋白質(zhì)磷酸化與肉品關(guān)系的探索比較缺乏。近年來，蛋白質(zhì)磷酸化的重要性引起了更多領(lǐng)域?qū)�業(yè)人員的關(guān)注，使人們對其與宰后肌肉品質(zhì)(主要是嫩度、顏色、保水性)的關(guān)系產(chǎn)生了興趣，并展開了不少的研究。

　　3.1 嫩度肉質(zhì)對消費者滿意度和吸引

　　他們再次購買非常重要，對肉類的總體滿意度首先與嫩度有關(guān)[46]。已有研究證明肉的嫩度受屠宰前因素(如品種、年齡、性別、處理)和屠宰后因素(如胴體處理、調(diào)理和老化)的單獨或共同影響[47]。畜禽宰后肌肉嫩度的變化會經(jīng)歷能量的代謝，糖酵解啟動產(chǎn)生ATP，直到糖酵解酶失活或肌糖原耗盡結(jié)束，持續(xù)的糖酵解作用會使乳酸含量逐漸增加，最終引起肌肉內(nèi) pH 的下降。糖酵解是宰后肌肉最主要的供能方式，糖酵解作用過快、過度或不足分別會產(chǎn)生蒼白、柔軟、滲出 ( pale, soft and exudative，PSE)肉和黑色、堅硬、干燥 (dark, firm and dry，DFD)肉[48]。

　　Li Chen 等人[49]在實驗中用蛋白激酶或磷酸酶抑制劑處理綿羊肌肉，蛋白質(zhì)磷酸化水平有顯著變化，并且測定了 pH 值和乳酸含量，數(shù)據(jù)表明高蛋白質(zhì)磷酸化水平，加快了糖酵解的速度。肌肉結(jié)構(gòu)(結(jié)締組織)和生化特性(肌原纖維和細胞骨架蛋白的蛋白分解)是影響牛肉嫩度變異的主要因素[50]。屠宰前應(yīng)激對肉質(zhì)有不良影響，可能導致牛產(chǎn)生 DFD 肉。Franco 等[51]研究探討了屠宰前應(yīng)激對牛胸最長肌中蛋白質(zhì)組的變化。采用 2-DE 和 MS 結(jié)合分析，共有 7 種差異結(jié)構(gòu)收縮蛋白和 3 種差異代謝酶。此外，2-DE 結(jié)合磷酸蛋白特異性熒光染料 Pro-Q DPS 發(fā)現(xiàn)，高磷酸化的快速骨骼肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈 2 亞型在肌肉轉(zhuǎn)化為 DFD 肉的過程中經(jīng)歷了最顯著變化。D’Alessandro 和 Huang Honggang等人[52-53]發(fā)現(xiàn)，宰后肌肉蛋白質(zhì)的磷酸化水平會發(fā)生顯著變化，但總蛋白質(zhì)磷酸化水平相對穩(wěn)定。

　　蛋白質(zhì)磷酸化是影響宰后肌肉向可食肉轉(zhuǎn)變的一個關(guān)鍵因素，不僅調(diào)節(jié)糖酵解酶活性，同時也調(diào)節(jié)原肌球蛋白等結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。陳立娟[54]以羊肉為實驗對象，發(fā)現(xiàn)高嫩度組的宰后羊肉中肌原纖維蛋白整體磷酸化水平低于低嫩度組，且鑒定到的磷酸化蛋白質(zhì)大多與肌節(jié)功能調(diào)節(jié)、糖酵解、肌肉收縮有關(guān)，表明蛋白質(zhì)磷酸化可通過調(diào)控這些環(huán)節(jié)間接影響宰后肌肉嫩度。宰后蛋白質(zhì)的水解在影響嫩度方面起著關(guān)鍵作用。

　　肌漿蛋白磷酸化可調(diào)節(jié) pH 下降速率，影響μ-鈣蛋白酶活性，進而影響蛋白質(zhì)的水解，最終改善肉質(zhì)[55]。劉滿順[56]以陜北白絨山羊的背最長肌和胸腹肉作為實驗材料，經(jīng)過檢測和分析技術(shù)得到 2125 條磷酸化肽段和 750 個磷酸化蛋白，超過五分之四的磷酸化蛋白質(zhì)主要參與代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)、信號傳導和生物過程調(diào)節(jié)，具有催化酶活性的功能。在肌肉蛋白結(jié)構(gòu)中，小熱休克蛋白(small heat shock proteins, sHSPs)可以模擬肌動蛋白，與肌動蛋白-肌動蛋白結(jié)合位點有效結(jié)合，能夠抑制肌動蛋白的聚合， sHSPs 這種對肌動蛋白聚合的抑制作用受其磷酸化狀態(tài)的影響，因此有觀點認為 sHSPs 可以通過其磷酸化水平的變化調(diào)節(jié)平滑肌收縮而改善肉的嫩度[57]。WengKaiqi 等人[58]對生長快速和慢速的肉雞進行了其肉質(zhì)差異產(chǎn)生的機制探討，慢速肉的紅色和黃色度較高，剪切力、宰后 24h pH 和蛋白質(zhì)含量較高，但肌內(nèi)脂肪含量較快速肉低。此外，基于磷酸化蛋白質(zhì)組學分析，上調(diào)磷酸化的肌原纖維蛋白導致更大的纖維，這有助于改善肉質(zhì)。糖酵解酶、磷酸化酶激酶和鈣相關(guān)蛋白的磷酸化蛋白顯著下調(diào)，降低了肉的酸度。這些磷蛋白為雞肉品質(zhì)的改良提供了重要的信息。

　　3.2 顏色雖然肉類的顏色并不是其安全性和質(zhì)量的可靠預(yù)測者，但這并不能避免消費者對其有特定的預(yù)期，消費者經(jīng)常將其作為肉類健康程度的指標，以此作為決定是否購買的基礎(chǔ)。因此，肉的顏色一直是世界范圍內(nèi)肉類研究人員關(guān)注的重要的品質(zhì)屬性之一[59]。

　　4 食鹽與蛋白質(zhì)磷酸化

　　日常生活中肉制品加工過程中會添加多種外源物，食鹽、糖較為常見�？茖W工作者們研究了食鹽與蛋白質(zhì)磷酸化的關(guān)系;全球食品減鹽大背景下，為了達到減鹽保質(zhì)的效果，對食鹽替代物進行了充分的試驗，氨基酸在肉制品加工過程中通過影響蛋白質(zhì)磷酸化水平從而改善肉質(zhì)的作用聯(lián)系正在被挖掘。

　　5 結(jié)語

　　蛋白質(zhì)磷酸化的檢測技術(shù)通常無法采取一種就可以達到檢測目的，暴露的缺點與其他方法聯(lián)用能有所彌補，發(fā)展磷酸化蛋白質(zhì)的檢測新技術(shù)和最佳的聯(lián)用組合仍需要一定時間的探索。畜禽肌肉中所含蛋白種類豐富，與磷酸化有聯(lián)系的蛋白結(jié)構(gòu)特性及其動態(tài)變化的位點需要更多試驗來發(fā)現(xiàn)。蛋白質(zhì)磷酸化動態(tài)調(diào)控是否與宰后肉品質(zhì)的風味、多汁性等指標有關(guān)仍有待研究。在肉與肉制品加工過程中會添加許多外源物，蛋白質(zhì)磷酸化影響肉制品的成熟發(fā)展，除食鹽與氨基酸以外的添加物是否與蛋白質(zhì)磷酸化有關(guān)并改善肉質(zhì)，還需研究證明，從而為肉品行業(yè)提供更多有價值的理論依據(jù)。

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　　作者：王文琪，張雅瑋*，李加慧，彭增起

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