本文摘要：摘要 綠僵菌是廣為知曉的昆蟲病原真菌，被用作生物殺蟲劑防治多種農(nóng)林植物害蟲。近年發(fā)現(xiàn)它也是根際微生物群落的一員，且有證據(jù)表明它內(nèi)生于一些植物的根組織中，具有促進植物生長、拮抗植物病原菌、誘導(dǎo)植物抗性等作用。本文著重綜述綠僵菌根際作用和植物內(nèi)生性研究進
摘要 綠僵菌是廣為知曉的昆蟲病原真菌，被用作生物殺蟲劑防治多種農(nóng)林植物害蟲。近年發(fā)現(xiàn)它也是根際微生物群落的一員，且有證據(jù)表明它內(nèi)生于一些植物的根組織中，具有促進植物生長、拮抗植物病原菌、誘導(dǎo)植物抗性等作用。本文著重綜述綠僵菌根際作用和植物內(nèi)生性研究進展，從對植物的直接作用角度，了解其田間生態(tài)適應(yīng)性及與植物的互作關(guān)系，以拓展昆蟲病原真菌作為植物保護劑的認識，有助于根據(jù)生態(tài)學(xué)特點制定未來的生物防治應(yīng)用策略。
關(guān)鍵詞 綠僵菌; 植物內(nèi)生真菌; 根際定殖; 真菌-植物互作; 植保多功能
自從1879年俄國學(xué)者 Metchnikoff成功地將綠僵菌用于田間防治金龜子[1]，綠僵菌屬 Metarhizium就成為了昆蟲病原 真 菌 的 典 型 代 表 被 廣 泛 知 曉，并作為模式菌激起研究熱點。其寄主范圍、地理分布、昆蟲致病性及致病機理等方面研究多有報道。至今，作為重要的生物防治資源，已在多種農(nóng)林害蟲的綠色防控，減少或替代化學(xué)殺蟲劑使用中發(fā)揮積極作用。
然而，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)綠僵菌也是一種可與植物直接交互作用的真菌，已證實其可棲息于植物根際和植物內(nèi) 部。近 二 十 年 來，有 關(guān) 綠 僵 菌與植物的相互關(guān)系及互作機理的研究逐漸增多，研究人員已逐步洞察到綠僵菌經(jīng)長期進化形成生態(tài)功能定位并與植物建立了多重關(guān)系，有的研究涉及綠僵菌的植物內(nèi)生性與其腐生性、昆蟲致病性的關(guān)聯(lián)比較，尤其在與植物互惠 共 生、促 進 植 物 生 長、誘 發(fā)植物抗性等方面已取得進展。綠僵菌與植物多方位的關(guān)聯(lián)為綠色植保及植物健康的系統(tǒng)研究提供了新視角，打開了新思路。
1 綠僵菌的生態(tài)定位與進化發(fā)展
生物物種的營養(yǎng)方式?jīng)Q定其生態(tài)地位。從發(fā)現(xiàn)綠僵菌感染昆蟲到現(xiàn)在，已明確其可侵染鞘翅目、鱗翅目、直 翅 目、半 翅 目、雙 翅 目、膜 翅 目 等 30 余 科200多種昆蟲[2-3]，無疑是重要的昆蟲病原真菌。綠僵菌屬由 Sorokin于1883年建立，在還未明確其有性階段前，綠僵菌被歸入半知菌類(fungiimperfecti)，隸屬 于 半 知 菌 亞 門 Deuteromycotina，絲 孢 綱 Hy-phomycetes，絲 孢 目 Hyphomycetales，叢 梗 孢 科Moniliaceae，科級還有絲孢科 Hyphomycetaceae、瘤座孢科 Tuberculariaceae等 不同 的 記 載[4-5]。直到戴氏蟲草被報道后，研究者誘發(fā)該 蟲 草 產(chǎn) 生 次 生 子囊孢子，并通過觀察次生子囊孢子的微循環(huán)產(chǎn)孢，確定了這種蟲草的無性型為戴氏綠僵菌 Metarhiziumtaii，至此才認識到綠僵菌與蟲草的對應(yīng)關(guān)系[6]。
另外，從 擬 布 里 特 班 克 蟲 草 Cordycepsbrittlebank-isoides 中也發(fā)現(xiàn)了其無性型綠僵菌，進一步證實了綠僵菌 和 蟲 草 之 間 是 無 性 型 和 有 性 型 的 對 應(yīng) 關(guān)系[7]。根據(jù)有性型 優(yōu) 先 的 原 則，綠 僵 菌 的 系 統(tǒng) 分 類地位應(yīng) 為 子 囊 菌 門 Ascomycota、盤 菌 亞 門 Pezizo-mycotina、糞 殼 菌 綱 Sordariomycetes、肉 座 菌 目Hypocreales麥角菌科 Clavicipitaceae。綠僵菌屬的物種可根據(jù)形態(tài)初步識別。分子標記特別是核酸序列分析技術(shù)極大地推進了綠僵菌分類系統(tǒng)的發(fā)展，目前以ITS 序 列 及 β-tubulin、rpb1、rpb2 和 ef-1α的多基因系統(tǒng)進化分析，可有效界 定 綠 僵 菌 屬 物 種間以及與相似真菌之間的邊界[8]。對采自不同環(huán)境和寄主的綠僵菌的分離鑒定及遺傳多樣性分析表明，綠僵菌經(jīng)過長期進化，已適應(yīng)了不同生存環(huán)境，形成了多重營養(yǎng)方式。除 了 寄 生各種昆蟲，利用其營養(yǎng)迅速增殖種群，還在土壤及植物根際棲息腐生，而且能與植物建 立 復(fù) 雜 的 兼 性 共生關(guān)系，以避免自身遭受 侵 害、保 存 種 質(zhì)，同 時 利 于宿主攝取營養(yǎng)和抵御病原[9-10]。
這種廣適性演化及生態(tài)功能引發(fā)了研究者的極大興趣。綠僵菌的多重生活方式是其長期適應(yīng)多變環(huán)境的進化結(jié)果。盡管人們對綠僵菌能夠定殖于植物根際并能棲息于植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)較晚、研究較少，對其昆蟲致病性發(fā)現(xiàn)更早、研 究 更 多，但是進化研究表明，綠僵菌是從與植物共生的真菌進化而來的，其 昆 蟲致病性是其在離開植物獨立宿存后獲得的感染和殺死昆蟲的能力[11]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，綠僵菌與草內(nèi)共生真菌麥角菌屬 Claviceps和香柱菌屬Epich-loe 真菌同 源 性 最 高[12]。
此外，比較 基 因 組 分 析 表明，與動物病原體相比，綠僵菌與植物內(nèi)生菌和植物病原體的關(guān)系更密切，而且相比類酵母菌、腐生性植物病原菌、內(nèi)生性植物病原菌，綠僵菌譜系與植物內(nèi)共生的一 種 香 柱 菌 Epichloefestucae 譜系分 化 得更晚(大約100 MYA)[13]。綠僵菌基因組中有大量的植物降解酶基因，也支持其由植物共生真菌進化的觀點[14];至于綠 僵 菌 的 昆 蟲 致 病 性 基 因，可 能 是從涉及植物定殖相關(guān)基因或其他基因水平轉(zhuǎn)移的選擇而來[14]。而進化的真菌可能會在界間“跳躍”，從植物到昆蟲，再回到植物或仍然保持祖先的植物共生能力[15-16]，體現(xiàn)為生活方式的多樣性。對進化的理解有助于我們探索綠僵菌-昆蟲-植物的相互關(guān)系，尤其是作為昆蟲病原的綠僵菌直接與植物發(fā)生根際聯(lián)絡(luò)或內(nèi)共生的互惠關(guān)系。
2 綠僵菌的根際生存和促進植物生長作用
植物根際(rhizosphere)一般指根表至附近幾毫米范圍內(nèi)的在理化和生物特性上不同于原土體的土壤微域。在確認綠僵菌為昆蟲病原體后一個多世紀，才有了綠僵菌根際適應(yīng)(rhizosphere-competent)能 力的報道。
2002年首次報道從甘藍根際土壤中分離、鑒定出了金龜子綠僵菌 Metarhiziumanisopliae，并發(fā)現(xiàn)根際土壤內(nèi)的綠僵菌數(shù)量是根際外土壤的 4倍;將綠僵菌釋放到甘藍田間6個月后，其在根際土壤中的存活數(shù)量比在根外圍土壤 (bulksoil)中 高100倍，因此認為根際是綠僵菌的庇護所，根際因子對綠僵菌持續(xù)存活有促進作用[17]。該結(jié)論 后 續(xù) 在相似的試驗中陸續(xù)得到證實。將標記綠色熒光蛋白基因 gfp 的金龜子綠僵菌包衣玉米種子，播種后對金龜子綠僵菌的根際定殖及其數(shù)量動態(tài)監(jiān)測表明，根際土壤中的綠僵菌數(shù)量極顯著高于非根際土壤，并且在播種后10d數(shù)量達到最大，20～30d內(nèi)數(shù)量相對穩(wěn)定;而非根際土壤中的綠僵菌數(shù)量隨時間延長明顯降低，證明了綠僵菌孢子在玉米根際的高活力和定殖效果[18]。
像大多數(shù)昆蟲 病 原 真 菌 一 樣，綠 僵 菌 具 有 一 定的腐生能力。在離開昆蟲寄主的階段會面臨嚴峻的生存考驗，既要獲取營養(yǎng)維持生存，又要抵御不良環(huán)境因子。土壤是各種微生 物 的 庇 護 場 所，可 避 免 紫外線輻射、緩沖溫度和水分的急劇變化等。根 際 是土壤中 碳 元 素 的 富 集 區(qū) 域，因 為 植 物 代 謝 的 碳 有10%～40%以根分泌物、黏液、溶解物和脫落細胞的形式轉(zhuǎn)移 到 土 壤 中[19-20]。這些碳 源 可 以 被 各 種 腐生微生物利用，一些分泌物可能刺 激 或 抑 制 微 生 物活性和種群的發(fā)展。綠僵菌能否利用土壤或根際的碳源至關(guān)重要。將綠僵菌摻入到含有泥炭、樹 皮 的基質(zhì)中栽培云杉 Piceaabies，在342d內(nèi)17次采樣監(jiān)測綠僵菌種群數(shù)量，結(jié)果表明在基質(zhì)中綠僵菌 種群數(shù)量保持 在105～106cfu/g，其 在根 際 的 存 活 數(shù)量顯著高于在根外圍 的 存 活 數(shù) 量[21]。將綠僵 菌 與土壤混拌后用于池栽花生，每15d采樣檢測，發(fā)現(xiàn)施用的綠僵菌種群數(shù)量在初期快速下降，隨后逐 漸穩(wěn)定或有所恢復(fù)，根際種群相對于根外圍的種群 恢復(fù)較早、恢復(fù)程 度 更 高，且 有 從 根 外 圍 向 根 際 延 展生長 的 趨 勢，表 明 根 際 有 利 于 綠 僵 菌 種 群 宿 存 和增殖[22]。
綠僵菌在自然界中存在物種多樣性和生態(tài)位差別，因此不同種類或菌株表現(xiàn)出根 際 定 殖 能 力 的 強弱和宿主偏好不同。在對安徽省廣德市笄罩山毛竹Phyllostachysedulis 根際綠 僵 菌 組 成 及 其 生 態(tài) 位分布調(diào)查時，從不同海拔、不同坡向和不同季節(jié)采集的毛竹根系中共分離到4種綠僵 菌，經(jīng) 形 態(tài) 分 類 與分子鑒定，分 別 是 羅 氏 綠 僵 菌 M.robertsii、平沙綠僵菌 M.pingshaense、貴州綠 僵 菌 M.guizhouense和一個待 定 種 Metarhizium sp.，其中羅 氏 綠 僵 菌為優(yōu)勢種，廣泛分布于海拔100m 處，且在夏季種群數(shù)量達到高峰;待定種則主要分布于海拔400m 地帶;4種綠僵 菌 的 時 空 生 態(tài) 位 寬 度 和 重 疊 度 均 呈 現(xiàn)明顯的季節(jié)變化。
總體上春季的空 間 生 態(tài) 位 寬 度 最高，其中貴州綠僵菌的時間生態(tài)位寬度最低，待鑒定種的時間生態(tài)位寬度最高，而且貴 州 綠 僵 菌 和 待 定種的空間生態(tài)位重疊度 較 高，在 夏、秋 季，平 沙 綠 僵菌和羅氏綠僵菌的空間生態(tài)位重疊度最高，在冬季，待定種和平沙綠僵菌空間生態(tài)位重疊值最高[23]。從加拿大安大略省兩個 地 點 采 集 的200多 份草、野花、灌木和喬木的根系樣 本 中 分 離 到102個 綠僵 菌菌株，按植物類型劃分得到的分離檢出率在35%～63%，野花根系檢出最多。
經(jīng)鑒定，這些菌株歸屬于3個物種，即羅氏綠僵菌、褐色綠僵菌 M.brunneum和貴州綠僵菌。其中從草的根際只檢測到羅氏綠僵菌;野花根際同時檢測到3種綠僵菌，而且只有當存在羅氏綠僵菌時才同時出現(xiàn)其余2種;貴 州 綠 僵 菌在3種喬木(主要是糖楓 Acersaccharum)的根際中單獨出現(xiàn);而褐色綠僵菌可單獨地在灌木和喬木的根際中發(fā)現(xiàn)[24]。將3株羅氏 綠 僵 菌、3株 金 龜 子 綠僵菌、3株褐色綠僵菌和1株 蝗 綠 僵 菌 M.acridum的分別接種玉米，測試它們在根際的定殖能力，結(jié)果顯示10個菌株均能在玉米根部定殖，但蝗綠僵菌菌株和1個褐色綠僵菌菌株的定殖能力很弱[25]。綠僵菌不只是單向地從根際汲取碳源營腐生生活，同時也在植物攝取營養(yǎng)或在抵抗寄生物侵害和植食性動物啃食方面起積極作用。
上述報道的在玉米根際定殖力較強的8個綠僵菌菌株都能顯著促進植株的營養(yǎng)生長，其中褐色綠僵菌 Mb820和金龜子綠僵菌 Ma939處 理種 子 后2周時玉米葉領(lǐng)數(shù)較對照增加42.8%[20]。此外，還有不少綠僵菌促進植物生長的報道，例如，在花生播種時用金龜子綠僵菌分生孢子懸浮液浸種處理，4～10d內(nèi)，花生主根長度和側(cè)根數(shù)顯著高于對照;綠僵菌密度在前8d呈 波動趨勢，且處理植株的主根長度和側(cè)根數(shù)相對于對照的比 值 與 綠 僵 菌 存 活 密 度 有 顯 著 的 相 關(guān) 性[26]�；ㄉN植期間，分別于播種(0d)、幼苗(15d)、初花(30d)、盛花(45d)、結(jié)莢(60d)期施用金龜子綠僵菌，對根際綠僵菌數(shù)量監(jiān)測結(jié)果表明，初花期施用綠僵菌能夠最好地保持其種群數(shù)量，并且在施菌后30～45d綠僵菌數(shù)量顯著上升，此期間正值花生根系快速發(fā)育時期;初花期施用還能導(dǎo)致蠐螬死亡，致死率最高可達72%，而蠐螬減退率與花生產(chǎn)量顯著相關(guān)，因此 最 終 減 少 了 莢 果 受 損 率，提 高 了 花 生 產(chǎn)量[27]。
值得注意的是，用褐色綠僵菌處理大豆種子后播種，在植株莖中檢測到綠僵菌，而其在莖中的內(nèi)生增加了植株對大豆蚜 Aphisglycines 的敏感 性，植株上蚜蟲種群數(shù)量有所增加[28]，此現(xiàn)象最終是否對植物健康產(chǎn)生顯著的負面影響值得關(guān)注，也 提 示蟲- 菌 - 植物之間可能存在微妙關(guān)系，需 要 深 入探討。綠僵菌在根際 定 殖 過 程 中，還可通過影響根際微生物群落而對植物產(chǎn)生間接作用，這 種 作 用 主 要是通過拮抗、競爭或排斥植物病原體而促進植物健康生長。
室內(nèi)試驗顯示，能夠在玉米、棉花根際定殖的3株金龜子綠僵菌對幾種重要植物根系病菌均有顯著抑制作用。在對峙培 養(yǎng) 時，綠 僵 菌 與 病 原 菌 菌落之間形成明顯的拮抗隔離帶，5d時對棉花枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum、小麥紋枯病菌 Rhizoctoniacerealis 的 生 長 抑 制 率 分 別 為43.2%～49.5%、41.1%～45.6%，對玉米莖基腐病菌 Fusarium moniliforme 和 Pythium aphamide-imatum 的生長 抑 制 率 為 65.3% ～69.2%;對 油菜菌核病 菌Sclerotiniasclerotiorum 3d時 的抑 制 率為28.3%～34.2%，且在7d時對峙菌落間形成明顯的抑菌圈，病原菌基本上不能形成菌核，菌絲變褐老化。
采用106 cfu/mL 金 龜子 綠 僵 菌 分 生 孢 子 懸浮液處理，5d時對棉花枯萎病菌、小麥紋枯病菌的菌絲生長抑制率可分別達到70%和65%;濾除細胞的綠僵菌發(fā)酵液處理也能夠抑制這2種病原菌的菌絲生長，抑制率分別為57.0%～59.9%和48.5%～58.6%，并抑制分生孢子或菌 核 的 形 成[29]。在與菜豆根腐病菌Fusariumsolanif.sp.phaseoli的對峙培養(yǎng)試驗中，羅氏綠僵菌能夠顯著抑制病原菌生長，相對抑制率達到60%;同時羅氏綠僵菌的無細胞培養(yǎng)濾液對菜豆根腐病菌孢子萌發(fā)抑制率達到83%，且濾液中的抑制物具有熱穩(wěn)定性;當 接 種 菜 豆 根 腐病菌時，有綠僵菌定殖的菜豆植株 比 對 照 植 株 更 健壯，病情指數(shù)更低[30]。
田間施用綠僵菌會顯著影響土著微生物種群的消長和群落結(jié)構(gòu)變化。花生播種時施用金龜子綠僵菌，并對整個生長季的微生物種群變化進行監(jiān)測，結(jié)果表明金龜子綠僵菌對根際微生物的影響大于對根外圍微生物的影響，其中對放線菌的影響最大，真菌次之，對細菌影響最小。由于拮抗抑制作用，根際放線菌種群消長周期出現(xiàn)與對照完全相反的情形，且45d時回落至低點后不再回升;對真菌影響也較大，初期花生根際真菌種群的下降速度減緩，與對照相比，到達谷底的時間推遲了15d，但回升速度加快，到達峰值時間提前了15d，但峰值降低了1/3;在施菌后15～30d的幼苗至初花期土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化最為顯著，在盛花期后，3類微生物群落結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)趨近原來狀態(tài)[31]。進一步探討土著微生物種群變化與綠僵菌種群及植株發(fā)育相關(guān)性可能會獲知更多重要信息，包括綠僵菌影響土著微生物的主要物種及其種群變化，影響根際土壤元素、酶等組分變化及其對植株攝取氮、鉀等營養(yǎng)物調(diào)節(jié)發(fā)育作用等。
3 綠僵菌植物內(nèi)生性及定殖作用
植物內(nèi)生真菌(endophyticfungi)是指整個生活史或部分時段在植物健康組織內(nèi)生存，并 不 會 引 起宿主明顯病癥的一類真菌 (https：∥encyclopedia.thefreedictionary.com/endophytic)。綠僵菌在田間土壤中并非隨機分布，而是趨向于在植物根際宿存、增殖，說明其具有與植物共生的潛力。在 確 定 綠 僵菌根際定殖、促 進 植 物 發(fā) 育 功 能 后 將 近 十 年，Elena等[32]于2011年驗證了綠僵菌的內(nèi)生性。
研究者將金龜子綠僵菌3個菌株的分生孢子分別接種到番茄幼苗基部附近，處理21d 后從植株根和芽都能分離到這3個菌株，葉片中也分離到1個菌株，證明了綠僵菌的內(nèi)生性，并說明其能夠在植物內(nèi)部移動。此后，陸續(xù)有綠僵菌屬物種在不同農(nóng)作物中定殖和促進增 長 的 報 道，包 括 菜 豆[33]、大 豆[34]、玉 米[35]、小麥[36]、木薯[37]、蠶豆[38]、馬鈴薯[39]、谷物黑麥和奧地利冬豌豆[40]等。這些報 道 主 要 是 通 過 根 表 接 種 或基質(zhì)接種處理后，采用組織分離培養(yǎng)法分離菌落并鑒定，或通過真菌特異性染色(棉藍染色)根 組 織 切片的方法來鑒 定。Cai等 采用eGFP 標 記的 綠 僵 菌菌株處理玉米根部基質(zhì)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，從處理后14d的根中捕捉到熒光菌絲的清晰圖像，可見菌 絲 不 僅 在 根 表 增 殖 纏 結(jié)，還 進 入 了 根 組織，沿細胞 外 的 間 隙 縱 向 延 伸，甚至可增殖成菌絲團，直接可視化證明了綠僵菌的植物內(nèi)生性[41]。
與對昆蟲致病 能 力 類 似，綠僵菌在植物組織中的定殖能力因其種類和株系、寄主物種和環(huán)境條件(如紫外線輻射、溫度、濕度)而異[42]。將10個具有一定昆蟲致病力的分屬于9個種的綠僵菌菌株接種于不同供試植物，20d內(nèi)所有菌株均能在2種單子葉植物玉米和大麥根中內(nèi)生定殖，盡管菌株的定殖能力不同，但其定殖能力與它們對昆蟲的寄生能力無明顯關(guān)聯(lián);在4種雙子葉植物中，只在青椒中發(fā)現(xiàn)綠僵菌成功定殖，而在菜豆、豌豆和番茄中未檢測到綠僵菌內(nèi)生定殖，說明綠僵菌對寄主植物存在偏好性，更傾向于單子葉植物宿主[16]。
綠僵菌與許多 內(nèi) 生 真 菌 一 樣，在寄主植物組織中表現(xiàn)出根部優(yōu)先定位。在加拿大3個野外地點隨機采集禾本科和非禾本科植物，從97株不同植物的根、下胚軸、莖和葉中分 離 到 了 綠 僵 菌、球 孢 白 僵 菌Beauveriabassiana 及 食 線 蟲 的 厚 垣 普 可 尼 亞 菌Pochoniachlamydosporium，其中綠僵 菌 中95%為羅氏綠僵 菌，幾 乎 都 定 殖 于 植 物 的 根 部，只 有 不 到1%定殖 于 下 胚 軸 內(nèi)，在 莖 和 葉 中 均 未 發(fā) 現(xiàn) 綠 僵菌[43]。另外，對綠僵菌在大豆和玉米上的定殖模式進行分析后發(fā)現(xiàn)，作為內(nèi)生真菌，綠僵菌優(yōu)先定殖于下胚 軸(hypocotyl)，而在根表和根際定 殖，也 最 常見于下胚 軸 附 近 的 區(qū) 域[44]。這些結(jié) 果 與 綠 僵 菌 會優(yōu)先感染近地下植物組織(即根系)區(qū)域的昆蟲是一致的，反映出綠僵菌在土壤中能夠“因地制 宜”地 轉(zhuǎn)換植物內(nèi)生或昆蟲寄生的生活方式。盡管自然條件下綠僵菌都限于在宿主植物根系 中，但 通 過 某 些 接種方法，如葉面噴灑、莖注 射 和 種 子 浸 泡，也 能 觀 察到其在植物地上組織中定殖[45-47]。
4 綠僵菌與植物互作及共生機理
綠僵菌在植物根際和根內(nèi)定殖以及與植物的互作機理研究雖取得一定 進 展，但 仍 非 常 有 限。目 前的研究表明，綠僵菌可在植物組織 中 定 殖 并 與 宿 主持續(xù)共生，但并未發(fā)現(xiàn)其對植物具 有 類 似 昆 蟲 致 病性那樣的具體特征或機 制。然 而，其 定 殖 和 共 生 過程可能涉及大量基因和小分子，這 些 基 因 和 小 分 子有助于其在根際定殖、根上黏附、與宿主植物之間的交流及調(diào)節(jié)宿主的防御反應(yīng)等[46]。
綠僵菌的根際生存能力除了取決于綠僵菌物種或菌株自身特性外，植物根分泌物 是 影 響 其 根 際 生存的重要因 子。在 豇 豆 根 分 泌 物 中，8個 具 有 昆 蟲廣譜致病性的金龜子綠僵菌菌株萌發(fā)率表現(xiàn)出極顯著差異，并與 根 分 泌 物 濃 度 相 關(guān)。3個 根 際 定 殖 能力較強 的 菌 株 在 1 mg/mL 濃 度 下 的 萌 發(fā) 率 達 到76.6%～93.9%，根際定殖能力弱的菌株萌發(fā)率只有6.5%;在0.01mg/mL的極低濃度下，根際定殖能 力 最 強 的 菌 株 2575# 仍 能 保 持 88.6% 的 萌 發(fā)率[48]。
進一步通過微陣列基因表達分析，發(fā)現(xiàn)菌株2575# 在 12h 內(nèi)有29個基因上調(diào)表 達，21個 基 因下調(diào)表達。上調(diào)的基因涉 及 碳 水 化 合 物 代 謝、脂 質(zhì)代謝、輔助因子和維生素、能量代謝、蛋白質(zhì)水解、細胞外基質(zhì)/細胞 壁 蛋 白、轉(zhuǎn) 運 蛋 白、DNA 合 成、性周期和應(yīng)激反應(yīng)。然而，上調(diào)基因中有41.3%是假設(shè)基因或孤立基因，說明許多尚未鑒 定 的 基 因 參 與 了腐生相關(guān)的功能。值得關(guān) 注 的 是，在 已 知 蛋 白 的 編碼基因中，參 與 對 昆 蟲 致 病 的 類 枯 草 菌 素(subtili-sin)蛋 白酶 Pr1A 基因、對植 物 表 面 附 著 起 重 要 作用的黏附素 MAD2基因也 表 現(xiàn) 出 對 根 分 泌 物 的 上調(diào)反應(yīng)，說明綠僵菌具有受根分泌物誘導(dǎo)的根際定殖基因[49]。
關(guān)于綠僵菌從 根 際 向 根 組 織 中 轉(zhuǎn) 移 定 殖，通 過帶有 gfp 標記的羅氏綠僵菌得到了證明。將 gfp標記的羅氏綠僵菌孢子接種于土壤后，在 激 光 共 聚焦顯微鏡 下 觀 察 到 孢 子 在 柳 枝 稷 Panicumvirga-tum 和菜豆根表附著、萌發(fā)和定殖;并且在孢子萌發(fā)前1～2d就出現(xiàn)植物根毛細胞增殖;無細胞的綠僵菌濾液并不能刺激根毛的增殖;施菌后60d，可檢測到帶 gfp 標記的 菌 絲 體 在 菜 豆 根 皮 層 細 胞 內(nèi) 和 細胞間隙聚集，對植物沒有明顯的損害[33]。綠僵菌對植物的附著和侵入是由根際生存到根內(nèi)共生的聯(lián)結(jié)過程。實際上，根際生存、根表定殖到根內(nèi)定殖并非孤立事件，也沒有明顯界限，而是相互關(guān)聯(lián)的過程。只是為了便于觀察和研究描述而人為劃分的階段或狀態(tài)。因 此，根 際 互 作 或 內(nèi) 生 的 機 理可能是緊密相關(guān)的，存在共同的、連續(xù)相關(guān)的或遠程調(diào)節(jié)的分子反應(yīng)。其從腐生向植物內(nèi)生，或 向 作 為昆蟲病原的生活方式轉(zhuǎn)換可能涉及很多基因，例 如參與降解 植 物 宿 主 細 胞 壁 或 昆 蟲 角 質(zhì) 層 成 分 的 基因。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)綠僵菌有2種與其侵入昆蟲和定殖植物相關(guān)的黏 附 素 蛋 白 MAD1和 MAD2。在 大豆 根分泌物中，金龜子綠僵菌的 mad2 表達明顯增高，且與其在富營養(yǎng)的人工培養(yǎng)基上生長的表達相一致;而綠僵菌 在 昆 蟲 表 皮 或 淋 巴 液 中 生 長 時 主 要 表 達mad1，間接證明了綠僵菌根際營養(yǎng)方式和與植物共生互作可能與 MAD2相關(guān)[50]。進一步研究證明，綠僵菌在昆蟲或植物表皮附著時 MAD1或 MAD2分別上調(diào)表達，意味著綠僵菌進化出了適于昆蟲寄主和與 植 物 宿 主 共 生 的 機 制[51-52]。 并 且 相 對 于MAD1，MAD2有更多的多態(tài)性變化，說明是它推動了綠僵菌的適應(yīng)性進化，并參與了對植物的內(nèi)共生定殖[53]。
至于綠僵菌如何通過共生界面交換獲得植物碳源，研究人員發(fā)現(xiàn)了一個重要的寡糖轉(zhuǎn)運子(Metar-hiziumraffinosetransporter，MRT)基 因，它 對 綠僵菌攝取棉子糖和 蔗 糖 起 關(guān) 鍵 作 用。敲 除 Mrt基因的羅氏綠僵菌菌株在根系分泌物中生長不良，在根際定殖能力大大降低。MRT是蔗糖和半乳糖 苷的轉(zhuǎn)運子，干擾 MRT的表達 可 導(dǎo) 致 菌 株 在 蔗 糖 和半乳糖培養(yǎng)基上的生長大大減少或完全不生長，但不影響其在完全由葡萄糖亞基組成的單糖或寡糖培養(yǎng)基上的生長;同時，Mrt基因只 在 半 乳 糖 苷 和蔗糖的條件下上調(diào) 表 達。進 一 步 通 過 Mrt啟動子控制下表達綠色熒光蛋白基因，證 實 了 Mrt基 因在草根附近的胚芽中表達，但在根外圍土壤中不 表達。這些試驗證 明 了 綠 僵 菌 攝 取 特 定 的 寡 糖 碳 源對于 真 菌 - 植 物 共 生 關(guān) 系 的 建 立 至 關(guān) 重 要，而MRT轉(zhuǎn)運是一條植物源碳水化合物向真菌轉(zhuǎn)移 的潛在途徑[61]。
5 討論與展望
雖然微生物與植物互作和共生現(xiàn)象很常見，并已有較多的研究報道，但相關(guān)機理 至 今 仍 未 完 全 清楚。對綠僵菌與植物互作及共生關(guān)系的認知更為有限，還需要更多的研究。對 其 生 態(tài) 作 用 和 機 理 的 推測，一方面可從其他微生物如根瘤菌、叢枝菌根真菌與植物的共生關(guān)系中得到一些提示;另一方面，對綠僵菌的昆蟲致病機理已有較深入 了 解，而 其 對 昆 蟲的致病性是由植物內(nèi)生性進化出的一種適應(yīng)特征，那么或許可以結(jié)合其作為昆蟲病 原 的 致 病 機 理，追溯其中保留的植物內(nèi)生性的痕跡來做出某些判斷。
可能推及的共同認識是，經(jīng)過長期共同進化，微生物(如根瘤菌、叢枝菌根真菌等)與植物能夠 在 植 物 根際或根表產(chǎn)生可相互識別的分子 模 式，彼 此 也 具 備相應(yīng)的受體，植物受體識別微生物 分 子 模 式 后 激 活細胞膜蛋白，并 使 Ca2+ 或其他 離 子 通 道 開 閉 變 化，向胞內(nèi)傳遞信號，觸發(fā)胞內(nèi)各種分子響應(yīng)，包括轉(zhuǎn)錄重編程、防御反應(yīng)基因的上調(diào)或下調(diào)表達，營養(yǎng)代謝路徑的調(diào)控等，使宿主出現(xiàn)兼容和利于共生的狀態(tài)。由于進化，綠僵菌與植物相互識別的分子模式可能有多種類型，例如不同 的 寡 糖、不 同 的 肽 段 等，各 物種的分子模式存在相 對 特 異 性。
另 外，綠 僵 菌 對 昆蟲的致病性是其最利于增殖繁衍的成功進化，而 與植物的共生是兼性的，只是其多重生活方式之一，這種兼性共生可能是保持了祖先的植物共生能力，也可能是界間“跳躍”從昆蟲返回植物[15-16]，加上有其他微生物和/或真菌的競爭，這種兼性共生在植物中生存量通常較少或者有短暫性[62]。至今尚 未 發(fā) 現(xiàn)像根瘤或菌根那樣的共生表型，也還未確定綠僵菌與植物共生的標志物質(zhì)或分子，因此目前還主要從現(xiàn)象與功能的層面來分析闡釋。無論如何，綠僵 菌 的 植 物 根 際 定 殖 能 力 和 與 植物的內(nèi)共生關(guān)系已經(jīng)明確，并已證實這種關(guān)系是互惠的。
對于植物，綠僵菌具有促進植物生長發(fā)育、增強植株系 統(tǒng) 抗 性、拮 抗 植 物 病 原 等 益 處;對 于 綠 僵菌，有利于在無昆蟲寄主階段保持種群生存延續(xù)，甚至在極端不利環(huán)境下保存種質(zhì)。這種由進化形成的獨特多功能生態(tài)位蘊藏著重要的植物保護潛力。不僅可以利 用 綠 僵 菌 對 昆 蟲 的 致 病 性 作 為 有 效 殺 蟲劑，利用其腐生性進行大規(guī)模的人工培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)，還可以挖掘和利用其在植物根際定殖的能力和與植物共生的關(guān)系，維護田間長期的有效控害種群，建立有利 于 自 然 調(diào) 控、促進植物健康的生態(tài)體系。具體地，在綠僵菌的應(yīng)用策略上，把它納入農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的一員，在應(yīng)用實踐中，通過維護環(huán)境因子最大限度地保護其種 群 活 力，發(fā)揮其寄生害蟲、根 際/根 內(nèi)定殖促進植物生長、調(diào)節(jié)生態(tài)的潛力，實現(xiàn)綜合植物保護作用。
為此，可在選擇和構(gòu)建生防菌株時，除了注重對害蟲的致病力，還應(yīng)考察其對環(huán)境的生存適應(yīng)能力;除了在蟲害發(fā)生時釋放大量菌劑，還可在種植早期低劑量引入，并通過優(yōu)選助劑和農(nóng)事操作，保護和促進綠僵菌種群在根際定殖，發(fā)揮其促進根系發(fā)育、屏蔽根系害蟲的作用，或許在拮抗某些植物病原上也有潛力;進一步研究綠僵菌的植物內(nèi)共生作用，明確其誘導(dǎo)植物抗性機理，還可能通過促進與植物內(nèi)共生，構(gòu)建對病蟲害抗性的植物品系或栽培方法。未來在揭示植物-綠僵菌-昆蟲之間互作關(guān)系機制的基礎(chǔ)上，將可能實現(xiàn)綠僵菌 生 防 菌 劑 的 多 方位的綜合利用。
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作者：農(nóng)向群* ， 王廣君* ， 蔡 霓， 劉 蓉， 張澤華
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