本文摘要：摘要 綠僵菌是廣為知曉的昆蟲(chóng)病原真菌，被用作生物殺蟲(chóng)劑防治多種農(nóng)林植物害蟲(chóng)。近年發(fā)現(xiàn)它也是根際微生物群落的一員，且有證據(jù)表明它內(nèi)生于一些植物的根組織中，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、拮抗植物病原菌、誘導(dǎo)植物抗性等作用。本文著重綜述綠僵菌根際作用和植物內(nèi)生性研究進(jìn)
摘要 綠僵菌是廣為知曉的昆蟲(chóng)病原真菌，被用作生物殺蟲(chóng)劑防治多種農(nóng)林植物害蟲(chóng)。近年發(fā)現(xiàn)它也是根際微生物群落的一員，且有證據(jù)表明它內(nèi)生于一些植物的根組織中，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、拮抗植物病原菌、誘導(dǎo)植物抗性等作用。本文著重綜述綠僵菌根際作用和植物內(nèi)生性研究進(jìn)展，從對(duì)植物的直接作用角度，了解其田間生態(tài)適應(yīng)性及與植物的互作關(guān)系，以拓展昆蟲(chóng)病原真菌作為植物保護(hù)劑的認(rèn)識(shí)，有助于根據(jù)生態(tài)學(xué)特點(diǎn)制定未來(lái)的生物防治應(yīng)用策略。
關(guān)鍵詞 綠僵菌; 植物內(nèi)生真菌; 根際定殖; 真菌-植物互作; 植保多功能
自從1879年俄國(guó)學(xué)者 Metchnikoff成功地將綠僵菌用于田間防治金龜子[1]，綠僵菌屬 Metarhizium就成為了昆蟲(chóng)病原 真 菌 的 典 型 代 表 被 廣 泛 知 曉，并作為模式菌激起研究熱點(diǎn)。其寄主范圍、地理分布、昆蟲(chóng)致病性及致病機(jī)理等方面研究多有報(bào)道。至今，作為重要的生物防治資源，已在多種農(nóng)林害蟲(chóng)的綠色防控，減少或替代化學(xué)殺蟲(chóng)劑使用中發(fā)揮積極作用。
然而，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)綠僵菌也是一種可與植物直接交互作用的真菌，已證實(shí)其可棲息于植物根際和植物內(nèi) 部。近 二 十 年 來(lái)，有 關(guān) 綠 僵 菌與植物的相互關(guān)系及互作機(jī)理的研究逐漸增多，研究人員已逐步洞察到綠僵菌經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化形成生態(tài)功能定位并與植物建立了多重關(guān)系，有的研究涉及綠僵菌的植物內(nèi)生性與其腐生性、昆蟲(chóng)致病性的關(guān)聯(lián)比較，尤其在與植物互惠 共 生、促 進(jìn) 植 物 生 長(zhǎng)、誘 發(fā)植物抗性等方面已取得進(jìn)展。綠僵菌與植物多方位的關(guān)聯(lián)為綠色植保及植物健康的系統(tǒng)研究提供了新視角，打開(kāi)了新思路。
1 綠僵菌的生態(tài)定位與進(jìn)化發(fā)展
生物物種的營(yíng)養(yǎng)方式?jīng)Q定其生態(tài)地位。從發(fā)現(xiàn)綠僵菌感染昆蟲(chóng)到現(xiàn)在，已明確其可侵染鞘翅目、鱗翅目、直 翅 目、半 翅 目、雙 翅 目、膜 翅 目 等 30 余 科200多種昆蟲(chóng)[2-3]，無(wú)疑是重要的昆蟲(chóng)病原真菌。綠僵菌屬由 Sorokin于1883年建立，在還未明確其有性階段前，綠僵菌被歸入半知菌類(lèi)(fungiimperfecti)，隸屬 于 半 知 菌 亞 門(mén) Deuteromycotina，絲 孢 綱 Hy-phomycetes，絲 孢 目 Hyphomycetales，叢 梗 孢 科Moniliaceae，科級(jí)還有絲孢科 Hyphomycetaceae、瘤座孢科 Tuberculariaceae等 不同 的 記 載[4-5]。直到戴氏蟲(chóng)草被報(bào)道后，研究者誘發(fā)該 蟲(chóng) 草 產(chǎn) 生 次 生 子囊孢子，并通過(guò)觀察次生子囊孢子的微循環(huán)產(chǎn)孢，確定了這種蟲(chóng)草的無(wú)性型為戴氏綠僵菌 Metarhiziumtaii，至此才認(rèn)識(shí)到綠僵菌與蟲(chóng)草的對(duì)應(yīng)關(guān)系[6]。
另外，從 擬 布 里 特 班 克 蟲(chóng) 草 Cordycepsbrittlebank-isoides 中也發(fā)現(xiàn)了其無(wú)性型綠僵菌，進(jìn)一步證實(shí)了綠僵菌 和 蟲(chóng) 草 之 間 是 無(wú) 性 型 和 有 性 型 的 對(duì) 應(yīng) 關(guān)系[7]。根據(jù)有性型 優(yōu) 先 的 原 則，綠 僵 菌 的 系 統(tǒng) 分 類(lèi)地位應(yīng) 為 子 囊 菌 門(mén) Ascomycota、盤(pán) 菌 亞 門(mén) Pezizo-mycotina、糞 殼 菌 綱 Sordariomycetes、肉 座 菌 目Hypocreales麥角菌科 Clavicipitaceae。綠僵菌屬的物種可根據(jù)形態(tài)初步識(shí)別。分子標(biāo)記特別是核酸序列分析技術(shù)極大地推進(jìn)了綠僵菌分類(lèi)系統(tǒng)的發(fā)展，目前以ITS 序 列 及 β-tubulin、rpb1、rpb2 和 ef-1α的多基因系統(tǒng)進(jìn)化分析，可有效界 定 綠 僵 菌 屬 物 種間以及與相似真菌之間的邊界[8]。對(duì)采自不同環(huán)境和寄主的綠僵菌的分離鑒定及遺傳多樣性分析表明，綠僵菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化，已適應(yīng)了不同生存環(huán)境，形成了多重營(yíng)養(yǎng)方式。除 了 寄 生各種昆蟲(chóng)，利用其營(yíng)養(yǎng)迅速增殖種群，還在土壤及植物根際棲息腐生，而且能與植物建 立 復(fù) 雜 的 兼 性 共生關(guān)系，以避免自身遭受 侵 害、保 存 種 質(zhì)，同 時(shí) 利 于宿主攝取營(yíng)養(yǎng)和抵御病原[9-10]。
這種廣適性演化及生態(tài)功能引發(fā)了研究者的極大興趣。綠僵菌的多重生活方式是其長(zhǎng)期適應(yīng)多變環(huán)境的進(jìn)化結(jié)果。盡管人們對(duì)綠僵菌能夠定殖于植物根際并能棲息于植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)較晚、研究較少，對(duì)其昆蟲(chóng)致病性發(fā)現(xiàn)更早、研 究 更 多，但是進(jìn)化研究表明，綠僵菌是從與植物共生的真菌進(jìn)化而來(lái)的，其 昆 蟲(chóng)致病性是其在離開(kāi)植物獨(dú)立宿存后獲得的感染和殺死昆蟲(chóng)的能力[11]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，綠僵菌與草內(nèi)共生真菌麥角菌屬 Claviceps和香柱菌屬Epich-loe 真菌同 源 性 最 高[12]。
此外，比較 基 因 組 分 析 表明，與動(dòng)物病原體相比，綠僵菌與植物內(nèi)生菌和植物病原體的關(guān)系更密切，而且相比類(lèi)酵母菌、腐生性植物病原菌、內(nèi)生性植物病原菌，綠僵菌譜系與植物內(nèi)共生的一 種 香 柱 菌 Epichloefestucae 譜系分 化 得更晚(大約100 MYA)[13]。綠僵菌基因組中有大量的植物降解酶基因，也支持其由植物共生真菌進(jìn)化的觀點(diǎn)[14];至于綠 僵 菌 的 昆 蟲(chóng) 致 病 性 基 因，可 能 是從涉及植物定殖相關(guān)基因或其他基因水平轉(zhuǎn)移的選擇而來(lái)[14]。而進(jìn)化的真菌可能會(huì)在界間“跳躍”，從植物到昆蟲(chóng)，再回到植物或仍然保持祖先的植物共生能力[15-16]，體現(xiàn)為生活方式的多樣性。對(duì)進(jìn)化的理解有助于我們探索綠僵菌-昆蟲(chóng)-植物的相互關(guān)系，尤其是作為昆蟲(chóng)病原的綠僵菌直接與植物發(fā)生根際聯(lián)絡(luò)或內(nèi)共生的互惠關(guān)系。
2 綠僵菌的根際生存和促進(jìn)植物生長(zhǎng)作用
植物根際(rhizosphere)一般指根表至附近幾毫米范圍內(nèi)的在理化和生物特性上不同于原土體的土壤微域。在確認(rèn)綠僵菌為昆蟲(chóng)病原體后一個(gè)多世紀(jì)，才有了綠僵菌根際適應(yīng)(rhizosphere-competent)能 力的報(bào)道。
2002年首次報(bào)道從甘藍(lán)根際土壤中分離、鑒定出了金龜子綠僵菌 Metarhiziumanisopliae，并發(fā)現(xiàn)根際土壤內(nèi)的綠僵菌數(shù)量是根際外土壤的 4倍;將綠僵菌釋放到甘藍(lán)田間6個(gè)月后，其在根際土壤中的存活數(shù)量比在根外圍土壤 (bulksoil)中 高100倍，因此認(rèn)為根際是綠僵菌的庇護(hù)所，根際因子對(duì)綠僵菌持續(xù)存活有促進(jìn)作用[17]。該結(jié)論 后 續(xù) 在相似的試驗(yàn)中陸續(xù)得到證實(shí)。將標(biāo)記綠色熒光蛋白基因 gfp 的金龜子綠僵菌包衣玉米種子，播種后對(duì)金龜子綠僵菌的根際定殖及其數(shù)量動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)表明，根際土壤中的綠僵菌數(shù)量極顯著高于非根際土壤，并且在播種后10d數(shù)量達(dá)到最大，20～30d內(nèi)數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定;而非根際土壤中的綠僵菌數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯降低，證明了綠僵菌孢子在玉米根際的高活力和定殖效果[18]。
像大多數(shù)昆蟲(chóng) 病 原 真 菌 一 樣，綠 僵 菌 具 有 一 定的腐生能力。在離開(kāi)昆蟲(chóng)寄主的階段會(huì)面臨嚴(yán)峻的生存考驗(yàn)，既要獲取營(yíng)養(yǎng)維持生存，又要抵御不良環(huán)境因子。土壤是各種微生 物 的 庇 護(hù) 場(chǎng) 所，可 避 免 紫外線(xiàn)輻射、緩沖溫度和水分的急劇變化等。根 際 是土壤中 碳 元 素 的 富 集 區(qū) 域，因 為 植 物 代 謝 的 碳 有10%～40%以根分泌物、黏液、溶解物和脫落細(xì)胞的形式轉(zhuǎn)移 到 土 壤 中[19-20]。這些碳 源 可 以 被 各 種 腐生微生物利用，一些分泌物可能刺 激 或 抑 制 微 生 物活性和種群的發(fā)展。綠僵菌能否利用土壤或根際的碳源至關(guān)重要。將綠僵菌摻入到含有泥炭、樹(shù) 皮 的基質(zhì)中栽培云杉 Piceaabies，在342d內(nèi)17次采樣監(jiān)測(cè)綠僵菌種群數(shù)量，結(jié)果表明在基質(zhì)中綠僵菌 種群數(shù)量保持 在105～106cfu/g，其 在根 際 的 存 活 數(shù)量顯著高于在根外圍 的 存 活 數(shù) 量[21]。將綠僵 菌 與土壤混拌后用于池栽花生，每15d采樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)施用的綠僵菌種群數(shù)量在初期快速下降，隨后逐 漸穩(wěn)定或有所恢復(fù)，根際種群相對(duì)于根外圍的種群 恢復(fù)較早、恢復(fù)程 度 更 高，且 有 從 根 外 圍 向 根 際 延 展生長(zhǎng) 的 趨 勢(shì)，表 明 根 際 有 利 于 綠 僵 菌 種 群 宿 存 和增殖[22]。
綠僵菌在自然界中存在物種多樣性和生態(tài)位差別，因此不同種類(lèi)或菌株表現(xiàn)出根 際 定 殖 能 力 的 強(qiáng)弱和宿主偏好不同。在對(duì)安徽省廣德市笄罩山毛竹Phyllostachysedulis 根際綠 僵 菌 組 成 及 其 生 態(tài) 位分布調(diào)查時(shí)，從不同海拔、不同坡向和不同季節(jié)采集的毛竹根系中共分離到4種綠僵 菌，經(jīng) 形 態(tài) 分 類(lèi) 與分子鑒定，分 別 是 羅 氏 綠 僵 菌 M.robertsii、平沙綠僵菌 M.pingshaense、貴州綠 僵 菌 M.guizhouense和一個(gè)待 定 種 Metarhizium sp.，其中羅 氏 綠 僵 菌為優(yōu)勢(shì)種，廣泛分布于海拔100m 處，且在夏季種群數(shù)量達(dá)到高峰;待定種則主要分布于海拔400m 地帶;4種綠僵 菌 的 時(shí) 空 生 態(tài) 位 寬 度 和 重 疊 度 均 呈 現(xiàn)明顯的季節(jié)變化。
總體上春季的空 間 生 態(tài) 位 寬 度 最高，其中貴州綠僵菌的時(shí)間生態(tài)位寬度最低，待鑒定種的時(shí)間生態(tài)位寬度最高，而且貴 州 綠 僵 菌 和 待 定種的空間生態(tài)位重疊度 較 高，在 夏、秋 季，平 沙 綠 僵菌和羅氏綠僵菌的空間生態(tài)位重疊度最高，在冬季，待定種和平沙綠僵菌空間生態(tài)位重疊值最高[23]。從加拿大安大略省兩個(gè) 地 點(diǎn) 采 集 的200多 份草、野花、灌木和喬木的根系樣 本 中 分 離 到102個(gè) 綠僵 菌菌株，按植物類(lèi)型劃分得到的分離檢出率在35%～63%，野花根系檢出最多。
經(jīng)鑒定，這些菌株歸屬于3個(gè)物種，即羅氏綠僵菌、褐色綠僵菌 M.brunneum和貴州綠僵菌。其中從草的根際只檢測(cè)到羅氏綠僵菌;野花根際同時(shí)檢測(cè)到3種綠僵菌，而且只有當(dāng)存在羅氏綠僵菌時(shí)才同時(shí)出現(xiàn)其余2種;貴 州 綠 僵 菌在3種喬木(主要是糖楓 Acersaccharum)的根際中單獨(dú)出現(xiàn);而褐色綠僵菌可單獨(dú)地在灌木和喬木的根際中發(fā)現(xiàn)[24]。將3株羅氏 綠 僵 菌、3株 金 龜 子 綠僵菌、3株褐色綠僵菌和1株 蝗 綠 僵 菌 M.acridum的分別接種玉米，測(cè)試它們?cè)诟H的定殖能力，結(jié)果顯示10個(gè)菌株均能在玉米根部定殖，但蝗綠僵菌菌株和1個(gè)褐色綠僵菌菌株的定殖能力很弱[25]。綠僵菌不只是單向地從根際汲取碳源營(yíng)腐生生活，同時(shí)也在植物攝取營(yíng)養(yǎng)或在抵抗寄生物侵害和植食性動(dòng)物啃食方面起積極作用。
上述報(bào)道的在玉米根際定殖力較強(qiáng)的8個(gè)綠僵菌菌株都能顯著促進(jìn)植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，其中褐色綠僵菌 Mb820和金龜子綠僵菌 Ma939處 理種 子 后2周時(shí)玉米葉領(lǐng)數(shù)較對(duì)照增加42.8%[20]。此外，還有不少綠僵菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)的報(bào)道，例如，在花生播種時(shí)用金龜子綠僵菌分生孢子懸浮液浸種處理，4～10d內(nèi)，花生主根長(zhǎng)度和側(cè)根數(shù)顯著高于對(duì)照;綠僵菌密度在前8d呈 波動(dòng)趨勢(shì)，且處理植株的主根長(zhǎng)度和側(cè)根數(shù)相對(duì)于對(duì)照的比 值 與 綠 僵 菌 存 活 密 度 有 顯 著 的 相 關(guān) 性[26]�；ㄉN植期間，分別于播種(0d)、幼苗(15d)、初花(30d)、盛花(45d)、結(jié)莢(60d)期施用金龜子綠僵菌，對(duì)根際綠僵菌數(shù)量監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，初花期施用綠僵菌能夠最好地保持其種群數(shù)量，并且在施菌后30～45d綠僵菌數(shù)量顯著上升，此期間正值花生根系快速發(fā)育時(shí)期;初花期施用還能導(dǎo)致蠐螬死亡，致死率最高可達(dá)72%，而蠐螬減退率與花生產(chǎn)量顯著相關(guān)，因此 最 終 減 少 了 莢 果 受 損 率，提 高 了 花 生 產(chǎn)量[27]。
值得注意的是，用褐色綠僵菌處理大豆種子后播種，在植株莖中檢測(cè)到綠僵菌，而其在莖中的內(nèi)生增加了植株對(duì)大豆蚜 Aphisglycines 的敏感 性，植株上蚜蟲(chóng)種群數(shù)量有所增加[28]，此現(xiàn)象最終是否對(duì)植物健康產(chǎn)生顯著的負(fù)面影響值得關(guān)注，也 提 示蟲(chóng)- 菌 - 植物之間可能存在微妙關(guān)系，需 要 深 入探討。綠僵菌在根際 定 殖 過(guò) 程 中，還可通過(guò)影響根際微生物群落而對(duì)植物產(chǎn)生間接作用，這 種 作 用 主 要是通過(guò)拮抗、競(jìng)爭(zhēng)或排斥植物病原體而促進(jìn)植物健康生長(zhǎng)。
室內(nèi)試驗(yàn)顯示，能夠在玉米、棉花根際定殖的3株金龜子綠僵菌對(duì)幾種重要植物根系病菌均有顯著抑制作用。在對(duì)峙培 養(yǎng) 時(shí)，綠 僵 菌 與 病 原 菌 菌落之間形成明顯的拮抗隔離帶，5d時(shí)對(duì)棉花枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum、小麥紋枯病菌 Rhizoctoniacerealis 的 生 長(zhǎng) 抑 制 率 分 別 為43.2%～49.5%、41.1%～45.6%，對(duì)玉米莖基腐病菌 Fusarium moniliforme 和 Pythium aphamide-imatum 的生長(zhǎng) 抑 制 率 為 65.3% ～69.2%;對(duì) 油菜菌核病 菌Sclerotiniasclerotiorum 3d時(shí) 的抑 制 率為28.3%～34.2%，且在7d時(shí)對(duì)峙菌落間形成明顯的抑菌圈，病原菌基本上不能形成菌核，菌絲變褐老化。
采用106 cfu/mL 金 龜子 綠 僵 菌 分 生 孢 子 懸浮液處理，5d時(shí)對(duì)棉花枯萎病菌、小麥紋枯病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率可分別達(dá)到70%和65%;濾除細(xì)胞的綠僵菌發(fā)酵液處理也能夠抑制這2種病原菌的菌絲生長(zhǎng)，抑制率分別為57.0%～59.9%和48.5%～58.6%，并抑制分生孢子或菌 核 的 形 成[29]。在與菜豆根腐病菌Fusariumsolanif.sp.phaseoli的對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中，羅氏綠僵菌能夠顯著抑制病原菌生長(zhǎng)，相對(duì)抑制率達(dá)到60%;同時(shí)羅氏綠僵菌的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)濾液對(duì)菜豆根腐病菌孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到83%，且濾液中的抑制物具有熱穩(wěn)定性;當(dāng) 接 種 菜 豆 根 腐病菌時(shí)，有綠僵菌定殖的菜豆植株 比 對(duì) 照 植 株 更 健壯，病情指數(shù)更低[30]。
田間施用綠僵菌會(huì)顯著影響土著微生物種群的消長(zhǎng)和群落結(jié)構(gòu)變化�；ㄉシN時(shí)施用金龜子綠僵菌，并對(duì)整個(gè)生長(zhǎng)季的微生物種群變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明金龜子綠僵菌對(duì)根際微生物的影響大于對(duì)根外圍微生物的影響，其中對(duì)放線(xiàn)菌的影響最大，真菌次之，對(duì)細(xì)菌影響最小。由于拮抗抑制作用，根際放線(xiàn)菌種群消長(zhǎng)周期出現(xiàn)與對(duì)照完全相反的情形，且45d時(shí)回落至低點(diǎn)后不再回升;對(duì)真菌影響也較大，初期花生根際真菌種群的下降速度減緩，與對(duì)照相比，到達(dá)谷底的時(shí)間推遲了15d，但回升速度加快，到達(dá)峰值時(shí)間提前了15d，但峰值降低了1/3;在施菌后15～30d的幼苗至初花期土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化最為顯著，在盛花期后，3類(lèi)微生物群落結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)趨近原來(lái)狀態(tài)[31]。進(jìn)一步探討土著微生物種群變化與綠僵菌種群及植株發(fā)育相關(guān)性可能會(huì)獲知更多重要信息，包括綠僵菌影響土著微生物的主要物種及其種群變化，影響根際土壤元素、酶等組分變化及其對(duì)植株攝取氮、鉀等營(yíng)養(yǎng)物調(diào)節(jié)發(fā)育作用等。
3 綠僵菌植物內(nèi)生性及定殖作用
植物內(nèi)生真菌(endophyticfungi)是指整個(gè)生活史或部分時(shí)段在植物健康組織內(nèi)生存，并 不 會(huì) 引 起宿主明顯病癥的一類(lèi)真菌 (https：∥encyclopedia.thefreedictionary.com/endophytic)。綠僵菌在田間土壤中并非隨機(jī)分布，而是趨向于在植物根際宿存、增殖，說(shuō)明其具有與植物共生的潛力。在 確 定 綠 僵菌根際定殖、促 進(jìn) 植 物 發(fā) 育 功 能 后 將 近 十 年，Elena等[32]于2011年驗(yàn)證了綠僵菌的內(nèi)生性。
研究者將金龜子綠僵菌3個(gè)菌株的分生孢子分別接種到番茄幼苗基部附近，處理21d 后從植株根和芽都能分離到這3個(gè)菌株，葉片中也分離到1個(gè)菌株，證明了綠僵菌的內(nèi)生性，并說(shuō)明其能夠在植物內(nèi)部移動(dòng)。此后，陸續(xù)有綠僵菌屬物種在不同農(nóng)作物中定殖和促進(jìn)增 長(zhǎng) 的 報(bào) 道，包 括 菜 豆[33]、大 豆[34]、玉 米[35]、小麥[36]、木薯[37]、蠶豆[38]、馬鈴薯[39]、谷物黑麥和奧地利冬豌豆[40]等。這些報(bào) 道 主 要 是 通 過(guò) 根 表 接 種 或基質(zhì)接種處理后，采用組織分離培養(yǎng)法分離菌落并鑒定，或通過(guò)真菌特異性染色(棉藍(lán)染色)根 組 織 切片的方法來(lái)鑒 定。Cai等 采用eGFP 標(biāo) 記的 綠 僵 菌菌株處理玉米根部基質(zhì)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察，從處理后14d的根中捕捉到熒光菌絲的清晰圖像，可見(jiàn)菌 絲 不 僅 在 根 表 增 殖 纏 結(jié)，還 進(jìn) 入 了 根 組織，沿細(xì)胞 外 的 間 隙 縱 向 延 伸，甚至可增殖成菌絲團(tuán)，直接可視化證明了綠僵菌的植物內(nèi)生性[41]。
與對(duì)昆蟲(chóng)致病 能 力 類(lèi) 似，綠僵菌在植物組織中的定殖能力因其種類(lèi)和株系、寄主物種和環(huán)境條件(如紫外線(xiàn)輻射、溫度、濕度)而異[42]。將10個(gè)具有一定昆蟲(chóng)致病力的分屬于9個(gè)種的綠僵菌菌株接種于不同供試植物，20d內(nèi)所有菌株均能在2種單子葉植物玉米和大麥根中內(nèi)生定殖，盡管菌株的定殖能力不同，但其定殖能力與它們對(duì)昆蟲(chóng)的寄生能力無(wú)明顯關(guān)聯(lián);在4種雙子葉植物中，只在青椒中發(fā)現(xiàn)綠僵菌成功定殖，而在菜豆、豌豆和番茄中未檢測(cè)到綠僵菌內(nèi)生定殖，說(shuō)明綠僵菌對(duì)寄主植物存在偏好性，更傾向于單子葉植物宿主[16]。
綠僵菌與許多 內(nèi) 生 真 菌 一 樣，在寄主植物組織中表現(xiàn)出根部?jī)?yōu)先定位。在加拿大3個(gè)野外地點(diǎn)隨機(jī)采集禾本科和非禾本科植物，從97株不同植物的根、下胚軸、莖和葉中分 離 到 了 綠 僵 菌、球 孢 白 僵 菌Beauveriabassiana 及 食 線(xiàn) 蟲(chóng) 的 厚 垣 普 可 尼 亞 菌Pochoniachlamydosporium，其中綠僵 菌 中95%為羅氏綠僵 菌，幾 乎 都 定 殖 于 植 物 的 根 部，只 有 不 到1%定殖 于 下 胚 軸 內(nèi)，在 莖 和 葉 中 均 未 發(fā) 現(xiàn) 綠 僵菌[43]。另外，對(duì)綠僵菌在大豆和玉米上的定殖模式進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，作為內(nèi)生真菌，綠僵菌優(yōu)先定殖于下胚 軸(hypocotyl)，而在根表和根際定 殖，也 最 常見(jiàn)于下胚 軸 附 近 的 區(qū) 域[44]。這些結(jié) 果 與 綠 僵 菌 會(huì)優(yōu)先感染近地下植物組織(即根系)區(qū)域的昆蟲(chóng)是一致的，反映出綠僵菌在土壤中能夠“因地制 宜”地 轉(zhuǎn)換植物內(nèi)生或昆蟲(chóng)寄生的生活方式。盡管自然條件下綠僵菌都限于在宿主植物根系 中，但 通 過(guò) 某 些 接種方法，如葉面噴灑、莖注 射 和 種 子 浸 泡，也 能 觀 察到其在植物地上組織中定殖[45-47]。
4 綠僵菌與植物互作及共生機(jī)理
綠僵菌在植物根際和根內(nèi)定殖以及與植物的互作機(jī)理研究雖取得一定 進(jìn) 展，但 仍 非 常 有 限。目 前的研究表明，綠僵菌可在植物組織 中 定 殖 并 與 宿 主持續(xù)共生，但并未發(fā)現(xiàn)其對(duì)植物具 有 類(lèi) 似 昆 蟲(chóng) 致 病性那樣的具體特征或機(jī) 制。然 而，其 定 殖 和 共 生 過(guò)程可能涉及大量基因和小分子，這 些 基 因 和 小 分 子有助于其在根際定殖、根上黏附、與宿主植物之間的交流及調(diào)節(jié)宿主的防御反應(yīng)等[46]。
綠僵菌的根際生存能力除了取決于綠僵菌物種或菌株自身特性外，植物根分泌物 是 影 響 其 根 際 生存的重要因 子。在 豇 豆 根 分 泌 物 中，8個(gè) 具 有 昆 蟲(chóng)廣譜致病性的金龜子綠僵菌菌株萌發(fā)率表現(xiàn)出極顯著差異，并與 根 分 泌 物 濃 度 相 關(guān)。3個(gè) 根 際 定 殖 能力較強(qiáng) 的 菌 株 在 1 mg/mL 濃 度 下 的 萌 發(fā) 率 達(dá) 到76.6%～93.9%，根際定殖能力弱的菌株萌發(fā)率只有6.5%;在0.01mg/mL的極低濃度下，根際定殖能 力 最 強(qiáng) 的 菌 株 2575# 仍 能 保 持 88.6% 的 萌 發(fā)率[48]。
進(jìn)一步通過(guò)微陣列基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)菌株2575# 在 12h 內(nèi)有29個(gè)基因上調(diào)表 達(dá)，21個(gè) 基 因下調(diào)表達(dá)。上調(diào)的基因涉 及 碳 水 化 合 物 代 謝、脂 質(zhì)代謝、輔助因子和維生素、能量代謝、蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞外基質(zhì)/細(xì)胞 壁 蛋 白、轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白、DNA 合 成、性周期和應(yīng)激反應(yīng)。然而，上調(diào)基因中有41.3%是假設(shè)基因或孤立基因，說(shuō)明許多尚未鑒 定 的 基 因 參 與 了腐生相關(guān)的功能。值得關(guān) 注 的 是，在 已 知 蛋 白 的 編碼基因中，參 與 對(duì) 昆 蟲(chóng) 致 病 的 類(lèi) 枯 草 菌 素(subtili-sin)蛋 白酶 Pr1A 基因、對(duì)植 物 表 面 附 著 起 重 要 作用的黏附素 MAD2基因也 表 現(xiàn) 出 對(duì) 根 分 泌 物 的 上調(diào)反應(yīng)，說(shuō)明綠僵菌具有受根分泌物誘導(dǎo)的根際定殖基因[49]。
關(guān)于綠僵菌從 根 際 向 根 組 織 中 轉(zhuǎn) 移 定 殖，通 過(guò)帶有 gfp 標(biāo)記的羅氏綠僵菌得到了證明。將 gfp標(biāo)記的羅氏綠僵菌孢子接種于土壤后，在 激 光 共 聚焦顯微鏡 下 觀 察 到 孢 子 在 柳 枝 稷 Panicumvirga-tum 和菜豆根表附著、萌發(fā)和定殖;并且在孢子萌發(fā)前1～2d就出現(xiàn)植物根毛細(xì)胞增殖;無(wú)細(xì)胞的綠僵菌濾液并不能刺激根毛的增殖;施菌后60d，可檢測(cè)到帶 gfp 標(biāo)記的 菌 絲 體 在 菜 豆 根 皮 層 細(xì) 胞 內(nèi) 和 細(xì)胞間隙聚集，對(duì)植物沒(méi)有明顯的損害[33]。綠僵菌對(duì)植物的附著和侵入是由根際生存到根內(nèi)共生的聯(lián)結(jié)過(guò)程。實(shí)際上，根際生存、根表定殖到根內(nèi)定殖并非孤立事件，也沒(méi)有明顯界限，而是相互關(guān)聯(lián)的過(guò)程。只是為了便于觀察和研究描述而人為劃分的階段或狀態(tài)。因 此，根 際 互 作 或 內(nèi) 生 的 機(jī) 理可能是緊密相關(guān)的，存在共同的、連續(xù)相關(guān)的或遠(yuǎn)程調(diào)節(jié)的分子反應(yīng)。其從腐生向植物內(nèi)生，或 向 作 為昆蟲(chóng)病原的生活方式轉(zhuǎn)換可能涉及很多基因，例 如參與降解 植 物 宿 主 細(xì) 胞 壁 或 昆 蟲(chóng) 角 質(zhì) 層 成 分 的 基因。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)綠僵菌有2種與其侵入昆蟲(chóng)和定殖植物相關(guān)的黏 附 素 蛋 白 MAD1和 MAD2。在 大豆 根分泌物中，金龜子綠僵菌的 mad2 表達(dá)明顯增高，且與其在富營(yíng)養(yǎng)的人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的表達(dá)相一致;而綠僵菌 在 昆 蟲(chóng) 表 皮 或 淋 巴 液 中 生 長(zhǎng) 時(shí) 主 要 表 達(dá)mad1，間接證明了綠僵菌根際營(yíng)養(yǎng)方式和與植物共生互作可能與 MAD2相關(guān)[50]。進(jìn)一步研究證明，綠僵菌在昆蟲(chóng)或植物表皮附著時(shí) MAD1或 MAD2分別上調(diào)表達(dá)，意味著綠僵菌進(jìn)化出了適于昆蟲(chóng)寄主和與 植 物 宿 主 共 生 的 機(jī) 制[51-52]。 并 且 相 對(duì) 于MAD1，MAD2有更多的多態(tài)性變化，說(shuō)明是它推動(dòng)了綠僵菌的適應(yīng)性進(jìn)化，并參與了對(duì)植物的內(nèi)共生定殖[53]。
至于綠僵菌如何通過(guò)共生界面交換獲得植物碳源，研究人員發(fā)現(xiàn)了一個(gè)重要的寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)子(Metar-hiziumraffinosetransporter，MRT)基 因，它 對(duì) 綠僵菌攝取棉子糖和 蔗 糖 起 關(guān) 鍵 作 用。敲 除 Mrt基因的羅氏綠僵菌菌株在根系分泌物中生長(zhǎng)不良，在根際定殖能力大大降低。MRT是蔗糖和半乳糖 苷的轉(zhuǎn)運(yùn)子，干擾 MRT的表達(dá) 可 導(dǎo) 致 菌 株 在 蔗 糖 和半乳糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)大大減少或完全不生長(zhǎng)，但不影響其在完全由葡萄糖亞基組成的單糖或寡糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng);同時(shí)，Mrt基因只 在 半 乳 糖 苷 和蔗糖的條件下上調(diào) 表 達(dá)。進(jìn) 一 步 通 過(guò) Mrt啟動(dòng)子控制下表達(dá)綠色熒光蛋白基因，證 實(shí) 了 Mrt基 因在草根附近的胚芽中表達(dá)，但在根外圍土壤中不 表達(dá)。這些試驗(yàn)證 明 了 綠 僵 菌 攝 取 特 定 的 寡 糖 碳 源對(duì)于 真 菌 - 植 物 共 生 關(guān) 系 的 建 立 至 關(guān) 重 要，而MRT轉(zhuǎn)運(yùn)是一條植物源碳水化合物向真菌轉(zhuǎn)移 的潛在途徑[61]。
5 討論與展望
雖然微生物與植物互作和共生現(xiàn)象很常見(jiàn)，并已有較多的研究報(bào)道，但相關(guān)機(jī)理 至 今 仍 未 完 全 清楚。對(duì)綠僵菌與植物互作及共生關(guān)系的認(rèn)知更為有限，還需要更多的研究。對(duì) 其 生 態(tài) 作 用 和 機(jī) 理 的 推測(cè)，一方面可從其他微生物如根瘤菌、叢枝菌根真菌與植物的共生關(guān)系中得到一些提示;另一方面，對(duì)綠僵菌的昆蟲(chóng)致病機(jī)理已有較深入 了 解，而 其 對(duì) 昆 蟲(chóng)的致病性是由植物內(nèi)生性進(jìn)化出的一種適應(yīng)特征，那么或許可以結(jié)合其作為昆蟲(chóng)病 原 的 致 病 機(jī) 理，追溯其中保留的植物內(nèi)生性的痕跡來(lái)做出某些判斷。
可能推及的共同認(rèn)識(shí)是，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期共同進(jìn)化，微生物(如根瘤菌、叢枝菌根真菌等)與植物能夠 在 植 物 根際或根表產(chǎn)生可相互識(shí)別的分子 模 式，彼 此 也 具 備相應(yīng)的受體，植物受體識(shí)別微生物 分 子 模 式 后 激 活細(xì)胞膜蛋白，并 使 Ca2+ 或其他 離 子 通 道 開(kāi) 閉 變 化，向胞內(nèi)傳遞信號(hào)，觸發(fā)胞內(nèi)各種分子響應(yīng)，包括轉(zhuǎn)錄重編程、防御反應(yīng)基因的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，營(yíng)養(yǎng)代謝路徑的調(diào)控等，使宿主出現(xiàn)兼容和利于共生的狀態(tài)。由于進(jìn)化，綠僵菌與植物相互識(shí)別的分子模式可能有多種類(lèi)型，例如不同 的 寡 糖、不 同 的 肽 段 等，各 物種的分子模式存在相 對(duì) 特 異 性。
另 外，綠 僵 菌 對(duì) 昆蟲(chóng)的致病性是其最利于增殖繁衍的成功進(jìn)化，而 與植物的共生是兼性的，只是其多重生活方式之一，這種兼性共生可能是保持了祖先的植物共生能力，也可能是界間“跳躍”從昆蟲(chóng)返回植物[15-16]，加上有其他微生物和/或真菌的競(jìng)爭(zhēng)，這種兼性共生在植物中生存量通常較少或者有短暫性[62]。至今尚 未 發(fā) 現(xiàn)像根瘤或菌根那樣的共生表型，也還未確定綠僵菌與植物共生的標(biāo)志物質(zhì)或分子，因此目前還主要從現(xiàn)象與功能的層面來(lái)分析闡釋。無(wú)論如何，綠僵 菌 的 植 物 根 際 定 殖 能 力 和 與 植物的內(nèi)共生關(guān)系已經(jīng)明確，并已證實(shí)這種關(guān)系是互惠的。
對(duì)于植物，綠僵菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)植株系 統(tǒng) 抗 性、拮 抗 植 物 病 原 等 益 處;對(duì) 于 綠 僵菌，有利于在無(wú)昆蟲(chóng)寄主階段保持種群生存延續(xù)，甚至在極端不利環(huán)境下保存種質(zhì)。這種由進(jìn)化形成的獨(dú)特多功能生態(tài)位蘊(yùn)藏著重要的植物保護(hù)潛力。不僅可以利 用 綠 僵 菌 對(duì) 昆 蟲(chóng) 的 致 病 性 作 為 有 效 殺 蟲(chóng)劑，利用其腐生性進(jìn)行大規(guī)模的人工培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)，還可以挖掘和利用其在植物根際定殖的能力和與植物共生的關(guān)系，維護(hù)田間長(zhǎng)期的有效控害種群，建立有利 于 自 然 調(diào) 控、促進(jìn)植物健康的生態(tài)體系。具體地，在綠僵菌的應(yīng)用策略上，把它納入農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的一員，在應(yīng)用實(shí)踐中，通過(guò)維護(hù)環(huán)境因子最大限度地保護(hù)其種 群 活 力，發(fā)揮其寄生害蟲(chóng)、根 際/根 內(nèi)定殖促進(jìn)植物生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)生態(tài)的潛力，實(shí)現(xiàn)綜合植物保護(hù)作用。
為此，可在選擇和構(gòu)建生防菌株時(shí)，除了注重對(duì)害蟲(chóng)的致病力，還應(yīng)考察其對(duì)環(huán)境的生存適應(yīng)能力;除了在蟲(chóng)害發(fā)生時(shí)釋放大量菌劑，還可在種植早期低劑量引入，并通過(guò)優(yōu)選助劑和農(nóng)事操作，保護(hù)和促進(jìn)綠僵菌種群在根際定殖，發(fā)揮其促進(jìn)根系發(fā)育、屏蔽根系害蟲(chóng)的作用，或許在拮抗某些植物病原上也有潛力;進(jìn)一步研究綠僵菌的植物內(nèi)共生作用，明確其誘導(dǎo)植物抗性機(jī)理，還可能通過(guò)促進(jìn)與植物內(nèi)共生，構(gòu)建對(duì)病蟲(chóng)害抗性的植物品系或栽培方法。未來(lái)在揭示植物-綠僵菌-昆蟲(chóng)之間互作關(guān)系機(jī)制的基礎(chǔ)上，將可能實(shí)現(xiàn)綠僵菌 生 防 菌 劑 的 多 方位的綜合利用。
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作者：農(nóng)向群* ， 王廣君* ， 蔡 霓， 劉 蓉， 張澤華
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